油橄欖加工廢液對小麥和玉米種子萌發及相關酶活性的影響

劉　娜,白萬明,蘇玲玲,郭曉敏,孔維寶,3

( 1 西北師范大學 生命科學學院,蘭州 730070;2 隴南田園油橄欖科技開發有限公司,甘肅隴南 746000;3 甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心,蘭州 730070)

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油橄欖加工廢液對小麥和玉米種子萌發及相關酶活性的影響

劉娜1,白萬明2,蘇玲玲1,郭曉敏1,孔維寶1,3

( 1 西北師范大學 生命科學學院,蘭州 730070;2 隴南田園油橄欖科技開發有限公司,甘肅隴南 746000;3 甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心,蘭州 730070)

摘要:用不同稀釋倍數的油橄欖加工廢液(OMWS)處理小麥和玉米種子,采用計數法、測量法和比色法測定了發芽率、根長和相關生化參數,以探索OMWS對種子萌發特性及相關酶活性的影響。結果表明:不同稀釋倍數的OMWS對小麥和玉米種子的發芽率、發芽勢和生長存在不同程度的影響;低稀釋倍數(高濃度)的OMWS(原液和5倍稀釋液)在抑制種子發芽的同時,對葉芽和根的生長存在延緩甚至毒害作用;隨著稀釋倍數的提高(濃度降低),這種抑制作用逐漸減弱,而高稀釋倍數(30和50倍稀釋液)處理則表現出一定程度的促生作用,這種影響存在濃度依賴性。OMWS處理同樣可導致種子可溶性蛋白質含量以及過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的變化,呈現高濃度抑制和低濃度誘導增強的趨勢;OMWS處理后小麥和玉米根的生長與POD和PAL活性存在明顯正相關性。研究認為,OMWS對小麥和玉米種子的發芽及生長存在高濃度抑制和低濃度誘導的雙重作用,并可能以多酚的影響為主;鑒于OMWS中多酚及其氧化產物可能產生的高濃度抑制、植物毒性和低濃度誘導化感作用,其在用做有機肥料或土壤改良劑時應做適當稀釋處理。

關鍵詞:油橄欖加工廢液;小麥;玉米;種子;發芽力;酶活性

油橄欖(OleaeuropaeaL.)是世界著名的木本油料樹種,其成熟果實經物理壓榨分離后可制取橄欖油,橄欖油富含不飽和脂肪酸、酚類物質和脂溶性維生素等多種活性成分,是廣受世界人民青睞的高級食用植物油[1]。目前,在橄欖油加工過程中,油橄欖鮮果經磨漿、離心分離、生產初榨橄欖油后產生大量的油橄欖加工廢棄物(OMW),其中含有可觀的果渣油、橄欖多酚和萜類化合物等多種生物活性物質。這一具有經濟價值的加工副產物在國內未能得到深入研究和有效利用,造成了極大的資源浪費和環境污染[2]。隨著中國油橄欖產業的不斷發展,油橄欖種植面積、鮮果產量和國產橄欖油產量逐年增長,加之油橄欖果實加工的時間段相對集中,產生的OMW產量也隨之增加。對于國內油橄欖加工企業來說,如何在生產橄欖油的同時開發利用好OMW廢棄資源,是企業實現經濟和環境雙重效益亟待考慮并解決的重要問題[3-4]。

OMW中含有大量的植物營養素,其最簡單的利用方式是經預處理(脫油脂、過濾、自然發酵或堆肥)之后直接還田用做有機肥料。但是因OMW中含有高濃度的多酚及其氧化產物,使其對土壤生物和植物有一定的植物毒性。Piotrowska等[5]研究發現,施用OMW對土壤的短期影響主要表現為土壤物理、化學和生化特性的改變,例如微生物生物量、基礎呼吸、可溶性C和N、土壤水解酶和氧化還原酶活性的變化;同時,由于OMW存在的植物毒性使西紅柿種子的發芽能力大大降低。Altieri等[6]以不同濃度(0,25%,50%,75%)的OMW作為泥碳替代物,評價其作為草莓無土栽培生長基質的可行性,結果表明雖然高濃度的OMW添加量(75%)可造成培養早期對草莓輕微的植物毒性,但是產量數據和組織分析結果顯示OMW可替代泥炭作為一種有效、廉價的無土栽培營養基質。為了實現OMW的有效脫毒,Annibale等[7]用香菇(Lentinulaedodes)處理OMW評價真菌的脫毒效果,硬質小麥的發芽能力實驗結果表明,用香菇處理后OMW的植物毒性顯著降低;用未稀釋和稀釋2倍的經香菇真菌脫毒處理后的OMW進行小麥發芽實驗,其發芽率分別為34%和57%,而未經真菌處理對照組的發芽幾乎完全被抑制。這說明,OMW作為有機肥使用時,須慎重考慮其對土壤生物、植物種子和植物體存在的毒性問題。本試驗以小麥和玉米種子為供試植物材料,研究國產油橄欖三相分離廢棄物之一——油橄欖加工廢液(OMWS)對種子萌發特性及其相關抗氧化酶活性的影響,以期為認識OMWS對種子萌發特性的影響及其農業還田循環利用提供實驗依據和應用參考。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1材料與試劑小麥和玉米種子分別為市售‘隴春25號’和‘豫玉22號’種子。油橄欖加工廢液(OMWS)由隴南田園油橄欖科技開發有限公司提供,廢液置于密封塑料桶中在4 ℃下存放。實驗用水為蒸餾水,HgCl2、磷酸鹽、Tris堿、HCl、H2O2、愈創木酚、鄰苯二酚、考馬斯亮藍-G250、L-苯丙氨酸等所有試劑均為分析純,牛血清蛋白為生化試劑。

1.1.2儀器設備主要包括培養皿、BS210S型分析天平(北京賽多利斯)、Labtech UV-8100紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科)、CT15RT型臺式高速冷凍離心機(上海天美)、奧立龍MODEL868型pH計(美國熱電)、GZP-250S光照恒溫培養箱(上海精宏)和恒溫水浴鍋(江蘇金壇)。

1.2材料培養與處理

1.2.1油橄欖加工廢液(OMWS)浸種液的制備量取一定量OMWS,以5 000 g離心15 min,取上清液作為浸種原液,取適量浸種原液將其用無菌蒸餾水分別稀釋成不同濃度的OMWS,共設計原液(不稀釋)以及稀釋5、10、20、30、50倍6個處理液水平,處理液2 ℃低溫封存待用。測得OMWS浸種原液中總多酚和總糖含量分別為8.3和6.8 g·L-1,在不同稀釋倍數下處理液中的總多酚和總糖含量詳見圖1所示。

1.2.2種子的處理與培養分別將小麥和玉米種子分選清洗后先用0.1%的HgCl2溶液浸泡15 min消毒,再用蒸餾水反復沖洗3次,接著在20 ℃水浴鍋中用蒸餾水浸種吸水(小麥浸種12 h、玉米浸種24 h,中間換水間歇1次),然后隨機取種子置于鋪有2層濾紙的培養皿中(小麥種子每皿50粒,玉米種子每皿20粒),分別用適量不同稀釋度的OMWS噴施,以蒸餾水作對照,在無光照、(18±2) ℃溫度下進行發芽實驗,每個處理設置3個平行組,每隔12 h噴4 mL OMWS處理液或蒸餾水(對照組)。每天觀察發芽及生根情況并做好記錄和計數,發芽生長10 d后結束培養。

1.2.3粗酶液的提取發芽結束時取小麥和玉米幼苗,用蒸餾水反復沖洗干凈,再用濾紙吸干表面水分。將稱重后的樣品放入預冷的研缽中,加入約20倍(mL)預冷至4 ℃的提取液(pH 7.0,50 mmol·L-1磷酸緩沖液)和適量石英砂,充分研磨勻漿后將勻漿液移入50 mL離心管中,再用預冷的相同緩沖液洗滌完全研缽中的勻漿液,并一同移入離心管中,總提取液體積控制在40 mL左右,在4 ℃振蕩浸提30 min后以5 000 g離心20 min,取上清液用緩沖液定容至50 mL,適當稀釋后做為測定蛋白質和酶活力的試樣。

1.3測定指標及方法

1.3.1種子萌發指標種子培養期間每天統計種子萌發的粒數,萌發以胚芽突破種皮為標準。發芽率以每皿發芽種子數占總種子總數的百分比計。發芽勢以發芽3 d時發芽種子數占供試種子數的百分比計。發芽10 d結束時,采用測量法測定發芽種子的根長(cm)。

D0為原液,D5～D50分別表示原液稀釋5、10、20、30、50倍;下同

1.3.2蛋白質含量吸取上述粗酶液樣品0.5 mL,加蒸餾水0.5 mL,加5 mL考馬斯亮蘭染液,充分混合均勻,放置2～5 min后,以加1 mL水和5 mL染液試管作為空白對照,用1 cm光程比色杯在595 nm下測定光密度A595,計算蛋白質含量,單位表示為mg·g-1(鮮重)[8]。以不同濃度牛血清蛋白為標準溶液測定其相應光密度值A595,做出標準曲線,得到OMWS廢液中蛋白質含量的計算公式:C=499.49A-1.031 7(R2=0.993 4)。式中,C為蛋白質含量(mg·L-1),A為595 nm下的吸光值。

1.3.3酶活性相關酶活力測定方法參照文獻[8],并作適當改良。

(1)過氧化氫酶(CAT)活性準確吸取2.5 mL pH 7.0、50 mmol·L-1磷酸緩沖液和0.4 mL 0.1 mol·L-1H2O2,加入0.1 mL 粗酶液樣品后迅速搖勻啟動反應,每隔30 s記錄1次240 nm處的吸光值A240,記錄3 min,以每分鐘A240下降0.1計為1個酶活力單位U,結果以U·g-1(鮮重)表示。

(2)過氧化物酶(POD)活性準確吸取2.5 mL pH 7.0 50 mmol·L-1磷酸緩沖液和0.4 mL 0.1 mol·L-1愈創木酚(含5 mmol·L-1H2O2),加入0.1 mL試樣粗酶液迅速搖勻后啟動反應,每隔30 s記錄1次470 nm處的吸光值A470,記錄3 min,以每分鐘A470上升0.1計為1 U,結果以U·g-1(鮮重)表示。

(3)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性在試管中加入1.5 mL 0.1 mol·L-1pH 8.8 的Tris-HCl緩沖液,再加入1 mL 0.1 mol·L-1的L-苯丙氨酸底物,加入0.5 mL試樣粗酶液,搖勻后在37 ℃水浴中反應1 h,反應結束后測定290 nm處的吸光值A290,以1 mL 0.1 mol·L-1的L-苯丙氨酸加2 mL 0.1 mol·L-1pH 8.8的Tris-HCl緩沖液的試管作為空白對照。以每小時A290上升0.01計為1個酶活力單位U,結果以U·g-1(鮮重)表示。

1.4數據分析

用Excel 2007軟件對數據進行整理統計和繪圖,用Origin Pro 8.0軟件做顯著性分析。

2結果與分析

2.1不同濃度OMWS處理對小麥和玉米種子發芽率與發芽勢的影響

不同濃度OMWS處理對小麥種子的萌發有一定的影響。OMWS處理液在高濃度(如原液、D5)時對初期小麥種子的萌發有一定的抑制作用,而隨著稀釋倍數的增大,這種抑制作用隨之減緩。小麥種子萌發期間用原液直接處理的種子,雖然在初期得以萌發,但后期因持續處理卻使已萌發的種子大部分死亡,不能正常生長(圖2,A中用虛線示意部分),而其他濃度處理組的小麥種子發芽率均達到了100%(圖2,A)。另外,除OMWS原液處理組的小麥種子發芽勢為83.3%之外,其他處理組均達到了100%(圖2,C)。說明適當稀釋后的OMWS對小麥種子的發芽影響較小,同時也表明實驗用小麥種子的活力較強、發芽整齊度較高。

同時,不同濃度OMWS處理對玉米種子發芽的影響也較為顯著,且OMWS的處理濃度越高(即稀釋倍數越小),抑制玉米種子發芽和延遲萌發的作用越明顯(圖2,B)。其中,高濃度的OMWS處理玉米種子后,其萌發特性和小麥種子類似,起始萌發的種子經OMWS持續處理后部分死亡;而隨著OMWS處理濃度的降低,玉米種子的發芽率逐漸升高,D50處理組的發芽率和發芽勢與對照組基本持平。由圖2,C可知,與小麥種子的發芽勢表現不同,玉米種子發芽勢在不同濃度處理組別之間存在較大差異,反映出不同濃度OMWS處理對其發芽存在的抑制作用,導致供試玉米種子發芽的整齊度差異較大。由圖2也反映出小麥種子的萌發時間較短,在發芽第2天即完全萌發,而玉米種子萌發的持續時間較長,在發芽第5天發芽率趨于恒定。

2.2不同濃度OMWS處理對小麥和玉米幼苗葉芽生長及生根的影響

從發芽10 d時各濃度處理組的典型性幼苗表現來看,不同濃度OMWS處理對小麥和玉米種子葉芽生長和生根作用的影響顯著(圖3)。與對照組相比,小麥和玉米種子萌發后其葉芽和根的生長與OMWS的處理濃度存在很高的相關性,即OMWS稀釋倍數越小、濃度越高,葉芽和根的長度越短,而且OMWS處理組的葉芽和根相比于對照組要粗壯一些。以上結果表明,OMWS處理對小麥和玉米的葉芽生長和生根有較大影響,較高濃度的OMWS在抑制和延緩種子萌發的同時,還抑制了葉芽和根的生長;而OMWS稀釋度較高、濃度較低的處理組(如D30和D50),對小麥和玉米葉芽和根的生長具有一定的促進作用;這種抑制或促進作用存在明顯的OMWS濃度依賴性。

進一步的根長調查結果顯示,不同濃度OMWS處理對小麥和玉米種子發芽后的生根作用影響顯著(圖4);與對照組相比,各實驗組測得平均根長均存在顯著性差異(P<0.05)。OMWS原液持續處理最終導致已發芽小麥種子的死亡,因此未能進行取樣測試。其中,小麥D5和D10處理組的根長分別顯著小于對照組96.5%和55.4%,而小麥D20、D30和D50組的根長分別顯著大于對照組71.5%、109.7%和172.2%;玉米原液組、D5、D10、D20和D30組的根長均顯著小于對照組,降幅為98.3%～41.7%,只有D50組的根長顯著大于對照組,增幅為16.7%。綜上結果可知,OMWS對小麥、玉米種子的發芽特性和生根的影響作用存在顯著的濃度依賴性,高濃度的OMWS在抑制種子發芽的同時也抑制根的生長,而使用較低濃度的OMWS處理(如D50)對種子的發芽影響較小,而且表現出一定的促進生長效果。

不同小寫字母表示處理組間在0.05水平存在顯著性差異;下同

2.3不同濃度OMWS處理對小麥和玉米全株幼苗可溶性蛋白質含量的影響

圖5結果顯示,不同濃度的OMWS處理對發芽結束時小麥和玉米全株幼苗可溶性蛋白質含量有不同程度的影響。其中,小麥幼苗可溶性蛋白質含量在高濃度OMWS處理組(原液組、D5和D10)與對照組存在顯著性差異,原液組顯著低于對照15.6%,D5和D10處理組分別顯著高于對照16.6%和14.3%,而其余處理組與對照組不存在顯著性差異;玉米幼苗可溶性蛋白質含量在原液、D5、D30、D50組處理下均顯著低于對照,降幅為39.6%～8.4%,在D10處理下卻顯著高于對照8.5%,而在D20組處理下與對照的含量相當。以上結果說明不同濃度的OMWS處理時導致種子處于不同的發芽態勢,導致其蛋白質分解程度的差異,進而導致全株幼苗可溶性蛋白質含量的差異。

圖3　不同OMWS處理組中小麥和玉米

圖4　不同濃度OMWS對小麥和

2.4不同濃度OMWS處理對小麥和玉米幼苗相關酶活性的影響

各實驗組全株幼苗發芽結束時抗氧化和生根相關的酶活性如圖6所示。首先,不同濃度OMWS處理對小麥和玉米幼苗過氧化氫酶(CAT)活性的影響顯著(圖6,A)。小麥和玉米幼苗的CAT活性在不同濃度OMWS處理下均顯著低于對照組,降幅分別為90.5%～41.1%和88.5%～12.3%,而且隨著OMWS處理濃度的降低總體呈現先升后降的變化趨勢;在OMWS處理組中,兩種作物幼苗CAT活性均以原液組呈現最低,而小麥幼苗CAT活性以D20和D30處理組的相對較高,玉米幼苗CAT活性則以D10組的相對較高。其次,小麥和玉米幼苗過氧化物酶(POD)活性均隨著OMWS處理濃度的降低(即稀釋倍數的增大)呈現逐漸上升的趨勢;各OMWS處理中,小麥和玉米幼苗的POD活性在原液、D5和D10組均顯著低于對照,小麥幼苗D20組和玉米幼苗的D20、D30處理組與對照無顯著差異,小麥幼苗D30、D50處理組和玉米幼苗的D50處理組均顯著高于對照組(圖6,B)。此外,小麥和玉米幼苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性在不同濃度OMWS處理下的變化趨勢與POD活性類似,即隨著OMWS處理濃度的降低均呈現逐漸上升的趨勢;幼苗PAL活性均在D20濃度時與對照組相當,處理濃度低于D20時顯著高于對照,處理濃度高于D20時顯著低于對照(圖6,C)。以上結果說明OMWS處理在影響小麥和玉米種子萌發的同時,也從生理生化水平上影響幼苗抗氧化酶及相關酶活性,而且其影響程度也隨著OMWS處理濃度的高低而存在差異。

圖5　小麥和玉米幼苗可溶性蛋白質含量

圖6　不同濃度OMWS處理下小麥和玉米

3討論

OMWS的主要成分為水、酚類物質、糖類、有機酸和礦物質等,其化學需氧量和生物需氧量高,有機物含量高、可生化處理特性強,富含生物活性物質,可開發利用價值高[9]。OMWS中酚類物質的主要種類有苯醇類(羥基酪醇)、環烯醚萜類(橄欖苦苷)、酚酸類、黃酮類等[10]。OMWS用作有機肥或土壤改良劑時,主要利用其中有益的有機碳、氮和礦物質等,而其中存在的高濃度多酚及其氧化產物對土壤生物和植物存在一定的植物毒性,應通過一定的預處理方式降低其毒性[11]。研究顯示酚類物質對苜蓿種子萌發存在顯著的濃度依賴性,而且因種類差異而存在不同程度的影響;在高濃度下(10-3mol·L-1),阿魏酸、香豆素、香草酸和香豆酸4種酚酸對苜蓿種子萌發均表現出顯著的抑制作用,其抑制作用隨著濃度的降低而逐漸減弱[12]。

首先,本研究中用不同濃度的OMWS處理小麥和玉米種子會對其萌發特性(發芽率和發芽勢)產生不同程度的影響。其中,高濃度的OMWS中因含有較高濃度的多酚(如原液組含量為8.3 g·L-1,D5組含量為1.66 g·L-1)會使種子萌發受到抑制(甚至產生毒害),導致已萌發的小麥和玉米種子在持續的處理過程中全部或部分死亡;而隨著OMWS處理濃度的降低,這種抑制作用逐漸減弱,相反在較低濃度(D30,0.28 g·L-1;D50,0.17 g·L-1)處理組種子的發芽率和發芽勢與對照組相當或略高。這主要是由于OMWS中高濃度多酚對種子萌發存在抑制作用,低濃度酚類物質存在一定的化感促生作用,而且其中含有的糖類和礦物質為種子萌發及生長提供了必要的營養物質。OMWS中的高濃度多酚對種子萌發及生長產生的毒性可能源于3個方面[12]:(1)高濃度多酚及氧化產物抑制種子萌發所需的關鍵酶類及細胞分裂,使種子萌發過程缺乏必須的能量以及合成代謝所需的中間產物,從而降低種子活力、抑制其萌發;(2)高濃度多酚改變種子萌發時種皮的滲透性以及種子的吸水作用,增加種子內部物質的大量滲透;(3)高濃度處理液中的糖類等營養物質導致微生物污染、生物酸化,從而造成種子腐爛或產生毒害。

其次,本研究中用不同濃度的OMWS持續處理小麥和玉米種子時,其在影響萌發特性的同時還影響生根和葉芽的生長。高濃度的OMWS在抑制萌發率和發芽勢的同時還抑制根和葉芽的生長,而隨著OMWS濃度的降低這種抑制作用逐漸消除。幼苗根和葉芽的生長與OMWS的稀釋倍數存在較高的相關性,小麥和玉米幼苗根的長度與OMWS稀釋倍數的相關系數r分別為0.961和0.994,與多酚濃度的相關系數分別為-0.588和-0.602。這一結果提示OMW作為土壤改良劑時對植物存在較強的化感作用,因酚類物質的濃度不同而對植株的生長產生不同的影響,外觀方面反映在幼苗根和葉芽的生長上。宋亮等[12]研究發現酚類物質對苜蓿幼苗生物量的影響同樣存在濃度依賴性。高濃度(10-3mol·L-1)的酚酸均顯著降低苜蓿幼苗地下生物量,而低濃度組(10-6mol·L-1)則表現出顯著的促進作用;酚酸化感物質處理苜蓿幼苗后,隨濃度的增加幼苗的地上及地下鮮重與對照相比逐漸降低。另有研究顯示[13],二硝基重氮酚廢水中的硝基酚類化合物污染土壤對上海青和小白菜2種蔬菜種子萌發與生長存在明顯的濃度梯度影響。土壤硝基酚類化合物含量在0～12 mg·kg-1時對上海青、小白菜的發芽率有不顯著的促進作用,超過24 mg·kg-1時對上海青發芽率產生明顯抑制,達到36 mg·kg-1時明顯抑制小白菜發芽率;污染土壤中硝基酚類化合物含量與2種蔬菜根和芽伸長抑制率呈顯著線性相關。酚酸對大豆種子萌發亦有影響,苯甲酸、肉桂酸、香草酸、2種混合酚酸及3種混合酚酸的協同處理均不同程度地抑制大豆種子的萌發,不僅降低其萌發率,胚根長和干重也有不同程度的降低[14]。本研究發現與上述結果相似。

第三,OMWS處理同樣影響小麥和玉米幼苗的可溶性蛋白質含量及CAT、POD和PAL活性。在發芽實驗結束時,較高濃度的OMWS原液處理嚴重抑制種子的萌發能力,導致種子蛋白質酶解作用受阻;中等濃度OMWS處理(D10)在適度抑制和延緩種子萌發的同時,造成蛋白質水解和營養物質轉化的緩慢進行,使其可溶性蛋白質含量相對較高;而低濃度OMWS處理組在促進種子萌發的同時,使較多的種子蛋白質水解產物轉化合成其它幼苗生長所需的物質,進而導致可溶性蛋白質含量降低。Roshchina等[15]研究了酚酸對大豆等4種種子的化感作用,認為對羥基苯甲酸和香草酸等化感物質通過抑制受體植物的抗氧化酶(SOD和CAT)活性,導致體內活性氧增多,造成膜質過氧化,從而破壞膜結構。與對照組相比,本研究中OMWS處理對小麥和玉米幼苗CAT、POD和PAL活性有不同程度的影響,且在高濃度條件下抑制作用顯著;與對照組相比,隨著OMWS濃度的降低,CAT活性呈先升后降,而POD和PAL活性呈逐漸增高趨勢。這種抑制主要和OMWS中存在的酚類物質等對種子的發芽與生長存在化感作用相關。分析認為,在不同濃度OMWS處理條件下,發芽結束時各組的幼苗處于不同的生長階段:高濃度組(原液和D5)抑制作用顯著導致種子死亡或發芽遲緩,中濃度(D10和D20)組雖有抑制延緩作用但種子能正常生長,而低濃度(D30和D50)組存在一定的誘導作用使種子萌發和生長相對較快。在OMWS作用下使種子處于不同的發芽程度是導致各實驗組酶活性存在較大差異的原因之一。另一原因可能和OMWS處理液中不同濃度的還原性酚類物質對CAT、POD和PAL活性存在一定的抑制或誘導作用有關。種子活力、生長特性與OMWS中多酚的濃度直接造成幼苗酶活性的差異。這一結果與酚酸物質對苜蓿幼苗POD活性的影響方式類似[12],即總體呈現高濃度抑制和低濃度誘導的趨勢。而CAT活性在低濃度組(D30和D50)逐漸降低可能歸因于OMWS中適宜濃度的多酚為種子發芽和生長提供了良好的抗氧化物質和還原力,進而抑制了CAT的活性。

另外,本研究發現,整株POD和PAL活性的變化趨勢與幼苗生根存在高度的相關性。其中,根長與其POD和PAL活性的相關系數在小麥中分別為0.827和0.740,在玉米中則分別為0.717和0.722;隨著OMWS濃度的降低,小麥和玉米的根長不斷增加,POD和PAL的活性也不斷升高。這一結果反映出POD和PAL在植株生根過程中存在促進作用。蔣小滿等[16]發現在誘導南瓜組培苗不定根形成過程中,POD活性及同工酶譜的變化與生根作用密切相關,不定根形成時POD活性迅速升高。POD活性與光葉楮扦插根的生長和延伸同樣存在密切關系[17]。PAL是苯丙烷類化合物生物合成的關鍵酶和限速酶,同時對誘導植物體合成木質素具有重要作用,因此PAL的活性直接影響植株體內酚類物質合成和根的生長[18]。

綜上所述,OMWS中存在的多種酚類物質直接通過化感作用影響小麥和玉米種子的萌發、幼苗和根的生長,以及幼苗蛋白質含量和相關酶(CAT、POD和PAL)活性,而且這種影響存在高度的濃度依賴性。OMWS中存在的多酚和糖類物質等對種子萌發和幼苗生長存在雙重作用和影響,即在高濃度處理時多酚對種子萌發和生長的抑制和毒害作用占主導地位,而在低濃度處理時其中的酚類物質、多糖和礦物質等通過協同化感作用產生促進作用。由此導致的種子發芽程度的不同進一步造成其生理生化參數的改變,最終影響幼苗的生長和生根作用。這一結果暗示OMWS作為有機肥或改良劑施用時應進行適當的稀釋處理以降低對植物的毒害作用,而在較低濃度水平施用可起到良好的化感作用和促生效果。今后進一步將從OMWS組成分析、微生物發酵預處理及其對土壤理化特性、土壤生物種類和豐度、植株地上/地下生物量的影響等方面進行探討。

參考文獻:

[1]KALUA C M,ALLEN M S,BEDGOODJR D R,etal.Olive oil volatile compounds,flavour development and quality:a critical review[J].FoodChemistry,2007,100(1):273-286.

[2]孔維寶,李陽,白萬明,等.微波輔助提取油橄欖果渣多酚的工藝研究[J].食品與發酵工業,2011,37(4):233-237.

KONG W B,LI Y,BAI W M,etal.Microwave assisted extraction of ployphenols from olive processing pomace[J].FoodandFermentationIndustries,2011,37(4):233-237.

[3]鄧煜,劉婷,梁芳.中國油橄欖產業現狀和對策[J].經濟林研究,2015,33(2):172-174.

DENG Y,LIU T,LIANG F.Status and countermeasures of olive industry in China[J].EconomicForestResearches,2015,33(2):172-174.

[4]MUKTADIRUL BARI CHOWDHURY A K M,AKRATOS C S,VAYENAS D V,etal.Olive mill waste composting:a review[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2013,85:108-119.

[5]PIOTROWSKA A,IAMARINO G,RAO M A,etal.Short-term effects of olive mill waste water(OMW) on chemical and biochemical properties of a semiarid mediterranean soil[J].SoilBiologyandBiochemistry,2006,38(3):600-610.

[6]ALTIERI R,ESPOSITO A,BARUZZI G.Use of olive mill waste mix as peat surrogate in substrate for strawberry soilless cultivation[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2010,64(7):670-675.

[7]D′ANNIBALE A,CASA R,PIERUCCETTI F,etal.Lentinula edodes removes phenols from olive-mill wastewater:impact on durum wheat(TriticumdurumDesf.) germinability[J].Chemosphere,2004,54(7):887-894.

[8]王學奎.植物生理生化實驗原理和技術(第2版)[M].北京:高等教育出版社,2006.

[9]ZBAKH H,ABBASSI A E.Potential use of olive mill wastewater in the preparation of functional beverages:a review[J].JournalofFunctionalFoods,2012,4(1):53-65.

[11]DERMECHE S,NADOUR M,LARROCHE C,etal.Olive mill wastes:biochemical characterizations and valorization strategies[J].ProcessBiochemistry,2013,48(10):1 532-1 552.

[12]宋亮,潘開文,王進闖,等.酚酸類物質對苜蓿種子萌發及抗氧化酶活性的影響[J].生態學報,2006,26(10):3 393-3 403.

SONG L,PAN K W,WANG J C,etal.Effects of phenolic acids on seed germination and seedling antioxidant enzyme activity of alfalfa[J].EcologicaSinica,2006,26(10):3 393-3 403.

[13]李清,楊愛江,劉方,等.二硝基重氮酚(DDNP)廢水中的硝基酚類化合物污染土壤對2種蔬菜種子萌發與生長的影響[J].西北農業學報,2013,22(2):159-163.

LI Q,YANG A J,LIU F,etal.Effect of the soil with pollution of dinitrodiazophenol(DDNP) wastewater with the itrophenols on the seed germination and growth of two vegetables[J].ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica,2013,22(2):159-163.

[14]陳龍,李建東,王國驕,等.幾種酚酸對大豆種子萌發的化感效應[J].種子,2011,30(5):83-86.

CHEN L,LI J D,WANG G J,etal.Allelopathy effects of several phenolic acids on seed germination of soybean[J].Seed,2011,30(5):83-86.

[15]ROSHCHINA V V,ROSHCHINA V D.The Excretory Function of Higher Plant[M].New York:SpringerLink,1993:213-215.

[16]蔣小滿,趙建萍,畢可華.“艾西絲”南瓜誘導生根過程中過氧化物酶活性及同工酶的研究[J].西北植物學報,1998,18(3):397-400.

JIANG X M,ZHAO J P,BI K H.Studies on peroxidise activity and isoperoxidase inCucurbitamoschataduring rooting induction[J].ActaBot.Boreal.-Occident.Sin.,1998,18(3):397-400.

[17]宋麗紅,曹幫華.光葉楮扦插生根的吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶、過氧化物酶活性變化研究[J].武漢植物學研究,2005,23(4):347-350.

SONG L H,CAO B H.Studies on activities of indoleacetic acid oxidase,polyphenol oxidase and peroxidase in cuttings ofBroussonetiapapyriferaduring rooting process[J].JournalofWuhanBotanicalResearch,2005,23(4):347-350.

[18]LIU C J,ZHANG X B.Multifaceted regulations of gateway enzyme phenylalanine ammonia-lyase in the biosynthesis of phenylpropanoids[J].MolecularPlant,2015,8(1):17-27.

(編輯:裴阿衛)

Effect of Olive Mill Wastewater on the Germinability and Related Enzyme Activities of Wheat and Maize Seeds

LIU Na1,BAI Wanming2,SU Lingling1,GUO Xiaomin1,KONG Weibao1,3

(1 College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China;2 Longnan Tianyuan Olive S&T Development Co.,Ltd.,Longnan,Gansu 746000,China;3 Bioactive Products Engineering Research Center for Gansu Distinctive Plants,Lanzhou 730070,China)

Abstract:The effects of different diluted olive mill wastewater(OMWS) on the germinability and related enzyme activities of wheat and maize seeds were investigated.The germination rate,root length,and related biochemical parameters were tested using the methods of counting,weigh,and colorimetry,respectively.The results showed that the influence on the germination rate,germination vigor,and growth was based on the concentrations of OMWS.The OMWS with low dilution ratio(Original and D5) treatments were not only inhibited the seeds germination,but also delayed the growth of leafbud and root,even had more phytotoxicity.The inhibition reduced with the decreasing of OMWS concentration.However,higher dilution ratio groups(D30 and D50) promoted the seed growth behavior.The effects of OMWS on the changes in soluble protein content,catalase(CAT),peroxidase(POD),and phenylanlanine ammonia lyase(PAL) activities also displayed the tendency of inhibition under high,and induction under low concentration.There was significant positive correlation between root length and POD and PAL activities.It was concluded from the results that the influence of OMWS on the germination and growth of wheat and maize seeds had dual effects with inhibition and induction according to the dilution of OMWS.The most important effect was possibly attributed to the contents of phenolic compounds in OMWS.In view of the phytotoxicity caused by phenolics and oxidation products,we suggest to do a dilution pretreatment when OMWS used as organic fertilizer or soil conditioner.

Key words:olive mill wastewater;wheat;maize;seeds;germinability;enzyme activity

中圖分類號:Q945.34;Q945.79

文獻標志碼:A

作者簡介:劉娜(1982-),女,碩士,實驗師,主要從事資源植物學研究。E-mail:liuna@nwnu.edu.cn

基金項目:國家自然科學基金(31360192);甘肅省基礎研究創新群體項目(1506RJIA116)

收稿日期:2015-11-15;修改稿收到日期:2016-01-06

文章編號:1000-4025(2016)03-0565-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0565