參芪益智顆粒對5XFAD轉基因小鼠學習記憶能力和腦內β淀粉樣蛋白1—42含量的影響

錢燕靜 甄軍麗 衛東鋒 鄭焱 王曉民

摘要：目的 觀察參芪益智顆粒對阿爾茨海默病5XFAD轉基因小鼠行為學和腦組織β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）含量的影響，探討其改善5XFAD小鼠學習記憶能力的作用機制。方法 將4月齡C57BL?6野生型小鼠隨機分為生理鹽水對照組和中藥對照組，同時將同月齡5XFAD小鼠隨機分為模型組、參芪益智顆粒組和石杉堿甲組，每組15只，各給藥組給予相應藥物灌胃，連續60 d。給藥結束后，采用筑巢實驗、避暗實驗和Morris水迷宮實驗評價各組小鼠學習和記憶能力；免疫組化和免疫熒光方法觀察各組小鼠皮層和海馬組織老年斑塊、Aβ1-42、小膠質細胞激活的標記物小膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白1及星形膠質細胞激活標記物膠質纖維酸性蛋白含量的變化。結果 與生理鹽水對照組比較，模型組小鼠筑巢實驗得分明顯降低，避暗實驗步入潛入期明顯縮短，水迷宮實驗逃避潛伏期明顯延長，腦內老年斑塊明顯增多，Aβ1-42含量明顯升高，膠質細胞激活明顯增強。參芪益智顆粒組小鼠上述指標均恢復或接近至野生型小鼠水平，與模型組小鼠比較差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。結論 參芪益智顆粒改善5XFAD小鼠學習和記憶能力的機制與減少腦內老年斑數量、抑制膠質細胞過度激活、減少腦內Aβ1-42的含量有關。

關鍵詞：參芪益智顆粒；阿爾茨海默病；5XFAD轉基因小鼠；學習和記憶；β淀粉樣蛋白；神經膠質細胞

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）05-0051-06

Effects of Shenqi Yizhi Granules on Ability of Learning and Memory and Content of Aβ1-42 of Cerebral Tissue in 5XFAD Mice with Alzheimers Disease QIAN Yan-jing1，2， ZHEN Jun-li1，2， WEI Dong-feng3， ZHENG Yan1，2， WANG Xiao-min1，2 （1. Department of Neurobiology， Key Laboratory for Neurodegenerative Disorders of the Ministry of Education， College of Basic Medicine of Capital Medical University， Beijing 100069， China； 2. Beijing Institute for Brain Disorders， Beijing 100069， China； 3. Institute of Basic Research in Clinical Medicine， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

Abstract： Objective To study the effects of Shenqi Yizhi Granules （SQYZ） on learning and memory and content of Aβ1-42 of cerebral tissue in 5XFAD mice with Alzheimers disease； To discuss its mechanism on improving learning and memory ability of 5XFAD mice. Methods Four-month-old C57BL?6 wild type mice were randomly divided into NS control group and SQYZ control group， and the 5XFAD mice were randomly divided into model group， SQYZ group and huperzine-A （HupA） group， 15 mice in each group. Each group were given same volume for gavage for 60 d. After treatment， the learning and memory ability were evaluated by nesting test， passive avoidance and Morris water maze test. The senile plaques and content of Aβ1-42， ionized calcium binding adapter molecule 1 and glial fibrillary acidic protein in cerebral cortex and hippocampus were detected by immunohistochemical staining and immunofluorescence， respectively. Results Compared with NS control group， the score of nesting test in model group significantly decreased； the step-through latency in passive avoidance was shortened and the escape latentcy in Morris water maze test was prolonged； the quantity of senile plaques and content of Aβ1-42 increased in cerebral cortex and hippocampus； the activation of glial cells significantly increased. In the SQYZ group， the above-mentioned indexes

基金項目：國家自然科學基金（81571038）；北京市屬高等學校創新團隊建設與教師職業發展計劃項目（IDHT20140514）

通訊作者：王曉民，E-mail：xmwang@ccmu.edu.cn

reached or approached the level of wild type control mice. The difference between SQYZ group and model group was statistically significant （P<0.05， P<0.01）. Conclusion SQYZ improved learning and memory ability in 5XFAD mice， which may be related to reduction of senile plaques， inhibition of over activation in glial cells and reduction of content of Aβ1-42 in cerebral cortex and hippocampus.

Key words： Shenqi Yizhi Granules； Alzheimer's disease； 5XFAD transgenic mice； learning and memory； Aβ1-42； glial cells

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種起病隱匿、以逐漸惡化性智能衰退為特征的神經退行性疾病，其主要臨床癥狀為進行性認知功能損害和精神行為異常[1]。隨著老齡化社會的到來，AD發病率逐漸上升，到2030年全世界的AD患者將達6500萬，給患者家庭和社會帶來沉重負擔[2]。AD患者大腦皮質和海馬是最常受損的腦區，病理改變主要表現為淀粉樣老年斑（senile plaque，SP），其中以β淀粉樣蛋白（Aβ）蛋白沉積學說較為重要[3-4]。目前，臨床治療AD的藥物如鹽酸美金剛和鹽酸多奈哌齊等均為單一作用靶點，常伴有明顯不良反應。AD屬中醫學“癡呆”范疇，為本虛標實之證，王永炎教授等認為“氣虛-血瘀-痰瘀-釀毒-病絡”為AD早期的核心病機，其中氣血虧虛是AD早期發生的前提條件，痰濁血瘀是引起AD的病理因素，毒損腦絡和病絡是早期AD發生的病機核心，使髓減腦消、神機失用，日久發為呆病。因此，針對以上病機，中醫臨床防治AD以益氣健脾、活血化瘀治其本，化痰清濁、解毒通絡、醒腦開竅治其標，使氣血充足、腦髓充盈、神機復用[5]。傳統中藥在改善AD患者認知功能方面具有悠久的歷史，積累了豐富的臨床實踐經驗，具有一定的潛在優勢和研發價值。參芪益智顆粒是總結王永炎教授長期臨床經驗的基礎上提煉出來的治療AD的經驗方，由黃芪、人參、黃芩等中藥組成，具有益氣健脾、活血化瘀、安神益智、解毒通絡之功效。本實驗以5XFAD轉基因小鼠為AD動物模型，采用筑巢實驗、避暗實驗、Morris水迷宮實驗、免疫組化及免疫熒光方法觀察參芪益智顆粒對5XFAD小鼠行為學和腦組織中SP、Aβ1-42、小膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白1（Iba1）及膠質纖維酸性蛋白（GFAP）含量的影響，探討參芪益智顆粒改善5XFAD小鼠學習記憶能力的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

5XFAD雜合體雙轉基因小鼠[含突變的APP基因（Swedish K670N和M671L；Florida I716V；London V717I）和早老素1基因（M146L和L286V）]源自美國Jackson實驗室，首都醫科大學動物實驗中心使用4月齡C57BL?6野生型小鼠30只（北京維通利華實驗動物技術有限公司）進行繁殖并鑒定。4月齡轉基因小鼠50只、雌雄各半，體質量（22±3）g，SPF級環境飼養，溫度（22±2）℃，相對濕度（55±5）%，分籠喂養，明暗交替12 h/12 h，自由攝食、飲水。

1.2 藥物

參芪益智顆粒提取液由中國中醫科學院中藥研究所提供，藥物濃度為2.24 g原藥材/mL（批號20140508），4 ℃保存備用。石杉堿甲（HupA，北京世紀奧科生物有限公司，批號MUST-13102808）。

1.3 主要試劑與儀器

小鼠抗小鼠Aβ為6E10，Covance公司，批號SIG-39300；兔抗小鼠Iba1，Wako公司，批號019-19741；兔抗小鼠GFAP，Millipore公司，批號MAB360；免疫組化Mouse ABC試劑盒（批號PK4002）、Rabbit ABC試劑盒（批號PK4001），Vector labs公司；DAB染色試劑盒（批號ZLI-9019）、488標記羊抗兔熒光二抗（批號ZF-0511）、594標記羊抗兔熒光二抗（批號ZF-0516），北京中杉金橋生物技術有限公司；Aβ1-42 ELISA試劑盒，美國Invitrogen公司，批號KHB3441。Morris水迷宮系統和視頻分析軟件（美國Actimetrics公司），穿梭避暗實驗箱（安徽正華生物儀器設備公司）。

1.4 分組及給藥

根據基因鑒定結果將小鼠按基因型分為野生型對照組（wild-type group，WT組）和轉基因模型組（trangenic group，Tg組）。實驗共分5組，野生型對照組隨機分為生理鹽水對照組（WT+NS組）和中藥對照組（WT+SQYZ組），Tg組隨機分為模型組（Tg+NS組）、參芪益智顆粒組（Tg+SQYZ組）及石杉堿甲組（Tg+HupA組），每組15只，雌雄各半。按藥物臨床使用劑量通過體表面積換算為小鼠給藥劑量，即參芪益智顆粒給藥劑量為5.55 g原藥材/（kg·d），石杉堿甲給藥劑量為0.1 mg/（kg·d）。WT+NS組和Tg+NS組灌服等量生理鹽水，每日1次，連續60 d。給藥結束后進行行為學檢測和病理觀察。

1.5 行為學檢測

1.5.1 筑巢實驗 該實驗用于檢測小鼠的自主行為和社交能力。首先將小鼠單籠放置，適應環境24 h 后，每籠中放入厚度為1 cm 的墊料，夜節律前2 h均勻平鋪放入剪裁大小一致的正方形無味薄紙巾片8份（每份含4張，每張邊長約4.5 cm），24 h后按照文獻[6]改良的4分法對筑巢質量進行評分：紙片雜亂散布在籠子各處，未被撕咬得1分；紙片被聚到籠子的一側，但較松散，無成型的巢，無明顯的撕咬或折疊得2分；紙片聚攏折疊呈成型但較平的巢，無明顯撕咬得3分；紙片聚攏折疊成較深的巢，并被撕咬成小塊得4分。

1.5.2 避暗實驗 該實驗用于檢測動物的條件學習記憶功能。①記憶獲取：將動物放在明室離門最遠處，背向洞口置于明室，記錄動物第1次進入暗室的時間（即步入潛伏期），動物進入暗室后對動物足底進行間斷的電刺激（50 Hz，36 V，1 s），5 min 后取出動物，放回籠中。②記憶測試：于24 h 后暗室內不給予電刺激，余條件同前，記錄小鼠5 min內進入暗室的錯誤次數、第1次進入暗室的步入潛伏期和5 min內在明室內的總時間[7]。

1.5.3 Morris水迷宮實驗 該實驗用于評價動物的空間學習和記憶能力。將水池隨機分為4個象限，實驗時平臺位置固定不變，置于第2象限中央，低于水面1～2 cm。實驗前1 d為適應及可視平臺階段，觀察其視覺及運動能力有無異常，對有異常的小鼠予以剔除。進行定位航行實驗時，平臺位于水面下1 cm，除平臺所在象限外的其他3個象限為入水點，該實驗歷時5 d，每日上下午各進行1次。將小鼠隨機從除平臺外的3個象限輕輕地面朝壁式入水，記錄60 s內找到平臺的時間（逃避潛伏期），并讓其在平臺上停留30 s。若小鼠60 s內未找到平臺，則潛伏期記為60 s。定位航行實驗結束后24 h，進行空間探索實驗，將水中平臺去除，選擇同一象限將小鼠頭朝池壁放入水中，記錄小鼠60 s內穿越平臺所在象限的時間百分比。

1.6 腦組織檢測

小鼠腹腔注射6%水合氯醛麻醉，剖開胸腔暴露心臟，經左心室灌流37 ℃生理鹽水50 mL。打開顱骨取出腦組織，一分為二，左側半球置于4%多聚甲醛后固定24 h，經20%、30%蔗糖溶液梯度脫水，OCT固定包埋，切片（厚度30 μm），并置于切片防凍液中備用。同時，將右側半球快速分離出皮層和海馬組織，經液氮快速冷凍后，-80 ℃冰箱凍存備用。

1.6.1 腦組織老年斑檢測 0.01 mol/L PBS洗滌腦片5 min×3次，3%H2O2室溫孵育30 min，再0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次；用與二抗來源一致的封閉血清室溫孵育1 h；滴加相應比例稀釋（1∶1000）的特異性一抗6E10，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次；加入二抗工作液，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3次；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌3次；DAB顯色（避光）1 min，PBS終止反應；貼片后自然晾干，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.6.2 皮層和海馬組織小膠質細胞和星形膠質細胞檢測 采用Iba1、GFAP抗體分別檢測小膠質細胞和星形膠質細胞數量的變化。將腦片浸入0.01 mol/L PBS中洗滌5 min×3次，0.3%Trition透膜30 min，再在0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次；用與二抗來源一致的封閉血清室溫孵育1 h；滴加相應比例稀釋的特異性一抗Iba1（1∶200）和GFAP（1∶500），4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次后，加入相應的熒光二抗工作液（避光）1 h，PBS洗滌后，貼片自然晾干，滴加封片劑，熒光顯微鏡下觀察。

1.6.3 皮層和海馬組織β淀粉樣蛋白1-42含量的測定 根據試劑盒說明書配制標準品和檢測劑工作液，樣品稀釋液與標準品稀釋液一致；將標準品和樣品依次加入孔板中（樣品設復孔），每孔50 L，加入待測Aβ1-42抗體50 L，室溫孵育3 h；洗板5次，加入100 L HRP偶聯二抗，室溫30 min；洗板5次，加入100 L Stabilized Chromogen（避光），室溫30 min，加入終止液；采用酶標儀讀板（檢測波長450 nm，參考波長570 nm），根據標準曲線顯示出待測樣品濃度，再乘以稀釋倍數即為原始濃度。

1.7 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示。水迷宮實驗逃避潛伏期應用Two-Way ANOVA分析。余檢測指標首先進行正態性檢驗，符合正態分布的數據，多組間比較采用One-Way ANOVA分析，若方差齊采用最小顯著差法進行兩兩比較，若方差不齊則采用Dunnetts T3檢驗進行兩兩比較；不符合正態分布的數據，采用非參數檢驗進行分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 參芪益智顆粒對5XFAD小鼠筑巢實驗的影響

2.2 參芪益智顆粒對5XFAD小鼠避暗實驗的影響

Tg+NS組較WT+NS組、WT+SQYZ組小鼠步入暗室錯誤次數增加、步入潛伏期縮短、明室總時間減少（P<0.05，P<0.01）；Tg+SQYZ組和Tg+HupA組較Tg+NS組小鼠進入暗室錯誤次數減少、步入潛伏期延長、明室總時間增加（P<0.05）。結果見表2。

2.3 參芪益智顆粒對5XFAD小鼠水迷宮實驗的影響

定位航行實驗從第4日開始，Tg+NS組小鼠逃避潛伏期較WT+NS組、WT+SQYZ組延長（P<0.05）；Tg+SQYZ組和Tg+HupA組小鼠逃避潛伏期較Tg+NS組縮短（P<0.05）。空間探索實驗，Tg+NS組小鼠游泳時間百分比較WT+NS組、WT+SQYZ組減少（P<0.01），Tg+SQYZ組和Tg+HupA組小鼠游泳時間百分比較Tg+NS組小鼠增加（P<0.05）。結果見表3。

2.4 參芪益智顆粒對5XFAD小鼠皮層和海馬組織老年斑含量的影響

WT+NS組和WT+SQYZ組小鼠皮層和海馬組織均未見SP。Tg+SQYZ組和Tg+HupA組較Tg+NS組小鼠皮層和海馬組織SP面積變小、數量減少（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。結果見圖1、表4。

皮層

海馬

2.5 參芪益智顆粒對5XFAD小鼠皮層和海馬組織小膠質細胞和星形膠質細胞激活的影響

Tg+NS組較WT+NS組、WT+SQYZ組小鼠皮層和海馬組織Iba1表達明顯升高（P<0.001）；Tg+SQYZ組和Tg+HupA組較Tg+NS組小鼠皮層和海馬組織Iba1、GFAP表達均明顯降低（P<0.05）。結果見表5。

2.6 參芪益智顆粒對5XFAD小鼠皮層和海馬組織β淀粉樣蛋白1-42含量的影響

Tg+SQYZ組和Tg+HupA組較Tg+NS組小鼠皮層和海馬組織Aβ1-42含量均明顯減少（P<0.05）。結果見表6。

3 討論

目前，AD病因及確切發病機制尚未完全闡明，較為公認的學說有Aβ級聯假說和β淀粉來源的彌散性配體（Aβ-derived diffusible ligands，ADDLs）假說，但2種假說均認為由單體Aβ1-42聚集成的寡聚體對神經元及突觸具有明顯損傷作用，指出Aβ1-42在AD的早期病理進程中具有重要影響。Aβ是跨膜淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）在內質網、高爾基體、溶酶體等細胞器經由β、γ分泌酶的蛋白水解作用代謝而產生的氨基酸多肽片段，因其具1個β片層二級結構而得名。正常情況下，腦內以Aβ1-40為主，而AD發生時其病理產物SP的主要成分則以Aβ1-42為主。Aβ1-42可通過細胞外降解、細胞內吞和轉運等機制被清除，而AD患者腦內上述Aβ清除機制明顯出現障礙，導致Aβ在腦內過量聚集，形成寡聚體，黏附于神經元，特異性地作用于突觸，干擾神經元之間的信號傳遞而導致明顯的學習記憶能力下降。因此，Aβ蛋白是AD發病的中心環節，寡聚化后形成SP，激活小膠質細胞和星形膠質細胞，進而促發炎癥反應，誘導神經元及突觸丟失，最終導致癡呆的發生。本實驗所使用5XFAD轉基因小鼠可共表達突變的人β-APP K670N和M671L、Florida突變I716V基因、London突變V717I以及突變早老素蛋白1（Presinilinl，PS1）M146L和L286V突變5個突變位點的基因，可較好地模擬AD患者的臨床病理特征，能夠在短期內產生大量Aβ1-42及ADDLs，4月齡時已經在大腦皮質、海馬等區域形成大量淀粉樣斑塊，這些改變隨年齡的增加逐漸加重，并表現出明顯的行為學異常[7]。本課題組前期實驗顯示，4月齡5XFAD小鼠開始出現空間認知功能障礙[8]，因此我們選取該月齡小鼠進行藥物干預實驗研究。

20世紀80年代，王永炎教授提出“毒邪”和“絡病”可作為中風、癡呆等疾病深入研究的切入點，認為“毒損腦絡”是癡呆發生發展的核心病機，并指出益氣活血、解毒通絡是治療癡呆的關鍵。參芪益智顆粒方中黃芪健脾益氣、升陽舉陷、托毒排膿，人參大補元氣、安神益智、補脾益肺、生津，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血，諸藥配伍，共奏健脾益氣、安神益智、活血化瘀、解毒通絡之功效?，F代藥理研究表明，參芪益智顆粒中有效活性成分黃芪總皂苷、黃芪多糖、人參皂苷、人參多糖、黃芩苷及黃芩素等均對AD動物模型具有認知功能改善作用，其機制與抑制腦內Aβ1-42產生、提高腦內神經遞質含量、保護線粒體能量代謝功能及增強腦組織抗氧化能力等密切相關[9-14]。

本研究通過多種行為學實驗檢測各組小鼠的認知功能，結果表明參芪益智顆粒能夠明顯改善5XFAD小鼠的社交行為和空間學習記憶能力。為進一步研究參芪益智顆粒改善5XFAD小鼠認知功能的作用機制，分別采用免疫組化和免疫熒光方法對各組小鼠皮層和海馬組織SP、Aβ1-42含量、小膠質細胞及星型膠質細胞激活情況進行了定性和定量觀察，免疫組化結果顯示，模型組小鼠腦組織SP面積及數量較野生型小鼠明顯增加，而參芪益智顆粒干預后小鼠腦組織SP面積明顯縮小，數量亦明顯減少；參芪益智顆粒組小鼠皮層及海馬組織可溶性及不可溶Aβ1-42含量均明顯降低。研究表明，AD亦是一個局灶性的、非免疫介導的神經系統炎性反應過程，在腦內可見到大量激活的小膠質細胞、反應性星形膠質細胞和炎性細胞因子等。活化的小膠質細胞和星形膠質細胞主要分布于Aβ沉積部位，并導致一系列神經系統的炎癥反應。本實驗中，免疫熒光檢測結果表明，模型組小鼠腦組織中活化的小膠質細胞和星形膠質細胞較野生型小鼠明顯增多，而參芪益智顆粒組2種膠質細胞激活明顯降低，提示參芪益智顆?？赡芡ㄟ^抑制膠質細胞激活，降低腦組織內的炎癥反應。

綜上所述，本研究采用5XFAD轉基因擬癡呆小鼠模型評價了參芪益智顆粒的腦保護作用，結果表明參芪益智顆粒能夠明顯改善5XFAD小鼠的學習記憶能力和社交行為，其作用機制與其能夠減少5XFAD小鼠皮層和海馬組織SP的面積及數量、降低小膠質細胞和星形膠質細胞的過度激活、減少腦內可溶性及不可溶Aβ1-42的含量相關。當然，參芪益智顆粒對5XFAD小鼠腦組織神經遞質含量、抗氧化能力、改善腦內線粒體能量代謝等方面的影響仍需進一步深入探討，以闡明其認知功能改善作用的分子機制，以期為參芪益智顆粒的臨床應用提供實驗依據。

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