槐耳板藍根雙向發酵提取物抑制乳腺癌MCF—7細胞遷移/侵襲及相關因子的研究

周蓉蓉 高鵬飛 張文意 張艷聰 馬維維 劉秋雨 史新元 連增林

摘要：目的 觀察槐耳板藍根雙向發酵產物對乳腺癌MCF-7細胞遷移、侵襲和相關因子的影響，探討其相關機制。方法 以人乳腺癌MCF-7細胞為模型，實驗分為對照組、板藍根組、槐耳組和槐耳板藍根組。MTT法檢測細胞增殖；細胞劃痕實驗檢測MCF-7細胞遷移能力；Transwell細胞侵襲實驗檢測MCF-7細胞侵襲能力；細胞黏附實驗檢測MCF-7細胞黏附能力；半定量RT-PCR檢測MCF-7細胞基質金屬蛋白酶（MMP-9）和波形蛋白（Vimentin）基因表達。結果 與板藍根組和槐耳組比較，槐耳板藍根組明顯抑制MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲和黏附（P<0.05），抑制MMP-9和Vimentin的基因表達（P<0.05）。結論 槐耳板藍根雙向發酵提取物可能通過下調MMP-9和Vimentin的基因表達抑制乳腺癌MCF-7細胞遷移、侵襲。

關鍵詞：槐耳；板藍根；雙向發酵；乳腺癌；遷移；侵襲；基質金屬蛋白酶；波形蛋白

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）05-0064-05

Effects of Trametes Robiniophila Murr and Isatidis Radix Bidirectional Fermentation Products on Migration/Invasion of Human Breast Cancer MCF-7 Cells and Relevant Factors ZHOU Rong-rong1， GAO Peng-fei1， ZHANG Wen-yi1， ZHANG Yan-cong1， MA Wei-wei1， LIU Qiu-yu1， SHI Xin-yuan1， LIAN Zeng-lin2 （1. School of Pharmaceutical Sciences， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China； 2. Beijing Handian Academy of Chinese Medicine， Handian Group， Beijing 100103， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on the migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cells and relevant factors； To discuss relevant mechanism of action. Methods Breast carcinoma cell line MCF-7 was used as research subject in this experiment. Control group， Isatidis Radix group， Trametes robiniophila Murr group， and Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix group were included in the experiment. The effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on MCF-7 cell proliferation were measured by MTT method. Cell scratch assay， transwell assay and adhesion assay were used to measure the effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on the migration， invasion and adhesion capability of MCF-7 cells， respectively. The effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on the mRNA expression of MMP-9 and Vimentin were measured by RT-PCR. Results Compared with Isatidis Radix group and Trametes robiniophila Murr group， Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products could significantly inhibit the proliferation， migration， invasion and adhesion capability of MCF-7 cells （P<0.05）. Similarly， Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products reduced the mRNA expression of MMP-9 and Vimentin （P<0.05）. Conclusion Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products may down-regulate the expression of MMP-9 and Vimentin to inhibit the migration， invasion and adhesion capabilities of MCF-7 cells.

Key words： Trametes robiniophila Murr； Isatidis Radix； bidirectional fermentation； breast cancer； migration； invasion； MMP-9； Vimentin

基金項目：北京市科技新星計劃交叉學科項目（xxhz201210）

通訊作者：史新元，E-mail：xyshi@126.com；連增林，E-mail：zenglinlian@aliyun.com

槐耳板藍根雙向發酵產物是基于20世紀80年代莊毅教授創立的現代中藥新型雙向發酵技術研制而成[1]。槐耳菌適應性廣泛，在發酵過程中可產生豐富的次生代謝產物，具有較好的輔助抗腫瘤作用[2-5]。板藍根含有豐富的營養物質，其化學成分基礎研究已較為成熟，且其所含化學成分靛玉紅已被證實具有提高免疫及抗腫瘤作用[6]。故采用具有一定活性成分的板藍根作為藥性基質，將槐耳和板藍根作為一對組合開展雙向發酵研究，以期發生增強藥效的協同作用，獲得更好的生物學效應。本課題組前期研究表明，發酵過程中菌質（靛藍、靛玉紅、精氨酸為主成分）薄層斑點隨發酵時間呈現規律變化，隨著發酵時間的延長，有新的斑點出現[7]。上述結果提示在雙向發酵過程中槐耳對板藍根藥材中的化學物質進行了轉化，并具有合成新化合物的能力。本研究以人乳腺癌細胞MCF-7為研究對象，分析槐耳板藍根雙向發酵產物對其遷移、侵襲及相關因子的影響。

1 實驗材料

1.1 細胞株

人乳腺癌細胞MCF-7，中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物及制備

槐耳，東北食藥真菌研究所。板藍根，安國市萌露中藥飲片有限公司，經北京漢典中醫研究院劉曄老師鑒定，符合2010年版《中華人民共和國藥典》標準。槐耳板藍根雙向發酵提取物：采取醇提、水提相結的方法，將槐耳板藍根雙向發酵產物中的藥效物質充分提取，最后經干燥制成提取物。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS，Hyclone，SH30070.03），0.25%胰蛋白酶（Hyclone，SH40003.01B），MTT（Amresco，0793-5g），二甲基亞砜（DMSO，Amresco，0231），MEM培養液（Hyclone，SH30024.01B），青鏈霉素混合液（Solarbio，P1400-100），25 cm2細胞培養瓶、96孔細胞培養板、6孔細胞培養板、移液管、Transwell小室（Corning），結晶紫染液（Sigma公司），PCR試劑盒（TaKaRa，RR019A），Matrigel基質膠（BD公司）。

YT-CJ-2ND型超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術有限公司），MCO-175 CO2培養箱（SANYO），BDS200倒置相差顯微鏡（奧特光學），MULTLSKAN MK3酶標儀（Thermo），LXJ-ⅡA型離心機（上海安亭科學儀器廠），BIOMATE型紫外可見分光光度計（Thermo），GE4852型PCR儀（杭州柏恒科技有限公司），JY600電泳儀（北京君意東方電子設備有限公司），ChampGel 5000型全自動凝膠成像系統（北京賽智創業科技有限公司），照相機（日本Canon）。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測細胞增殖作用

MCF-7細胞第3代經胰酶消化，用普通培養液（含10%FBS、1×105 U/L青霉素、100 mg/L硫酸鏈霉素的MEM培養液）稀釋成2.5×104個/mL細胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔培養板。細胞培養過夜后進行分組處理：對照組換用普通培養液，藥物干預組換用含槐耳、板藍根及槐耳板藍根雙向發酵提取物培養液各4 mg/mL。每組6個復孔，每孔加入上述培養液200 μL，繼續培養48 h。每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱內孵育4 h后，棄去培養液，每孔加入100 μL DMSO，室溫下振蕩15 min混勻。待沉淀完全溶解后，于酶標儀570 nm處測定光密度（OD）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（OD值空白孔-OD值測量孔）÷（OD值空白孔-OD值調零孔）×100%。

槐耳、板藍根和槐耳板藍根雙向發酵提取物藥液的制備：取槐耳、板藍根和槐耳板藍根雙向發酵提取物各0.5 g，溶于10 mL無血清MEM培養基液，搖勻，于4 ℃冰箱靜置過夜，4000 r/min離心10 min，取上層液于50 mL離心管中，另取10 mL無血清MEM培養基液，對下層沉淀再溶解，4000 r/min離心10 min，取上層液于50 mL離心管中，合并2次溶液，加無血清MEM培養基液至45 mL，另加5 mL FBS，得到10 mg/mL槐耳、板藍根和槐耳板藍根雙向發酵提取物母液（含10%FBS），0.45 μm濾器過濾，4 ℃冰箱保存備用。

2.2 細胞劃痕實驗檢測MCF-7細胞遷移能力

收集對數生長期MCF-7細胞，以2.5×105個/mL的密度接種于6孔中，2 mL/孔，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。培養至細胞長滿培養板后，吸棄上清液，用10 μL吸頭在6孔板上畫“一”字，PBS輕輕沖洗2次。對照組加入基礎培養基，藥物干預組分別加入終濃度為4 mg/mL板藍根、槐耳和槐耳板藍根雙向發酵提取物的MEM基礎培養基（無FBS），各3個復孔，在100倍倒置顯微鏡下，分別于藥物作用0、12、24 h時拍照，計算細胞愈合率（%）[（藥物作用前痕跡寬度-藥物作用后痕跡寬度）÷藥物作用前痕跡寬度×100%]。實驗重復3次。

2.3 Transwell細胞侵襲實驗檢測MCF-7細胞侵襲能力

Transwell小室及24孔板預冷，用無血清培養基按1∶5將Matrigel膠稀釋，每個Transwell小室鋪膠60 μL，37 ℃培養箱中過夜干燥，使用前無血清培養基水化30 min。收集對數生長期的MCF-7細胞，以2.5×105個/mL的密度接種于6孔板中，2 mL/孔，普通培養液培養過夜后，對照組加入基礎培養基，藥物干預組分別加入終濃度為4 mg/mL板藍根、槐耳和槐耳板藍根雙向發酵提取物的MEM基礎培養基（無FBS），設2個復孔，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。待藥物作用MCF-7細胞48 h后，PBS洗2次，0.25%胰酶消化細胞，1000 r/min離心5 min，棄上清液，MEM培養基（含1%BSA）重懸細胞，細胞計數，調整MCF-7細胞密度至1×105個/mL，Transwell小室下室加750 μL含10%FBS的MEM培養基，接種細胞，取細胞懸液200 μL加入Transwell小室上室，常規培養24 h。棄去小室內培養液，PBS洗2次，甲醇固定20 min，PBS洗2次，風干，用0.1%結晶紫染色15～20 min，用濕棉簽擦盡上室面的Matrigel基質膠和細胞，用清水洗3次，風干。將小室置于倒置顯微鏡下，PBS洗2次，選擇中及上、下、左、右共5個象限計數，小室下室面細胞數即為穿透基質膠的細胞數。實驗重復3次。

2.4 細胞黏附實驗檢測MCF-7細胞黏附能力

收集對數生長期MCF-7細胞，以2.5×105個/mL的密度接種于6孔板中，2 mL/孔，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。待24 h后，對照組加入基礎培養基，藥物干預組分別加入終濃度為4 mg/mL板藍根、槐耳和槐耳板藍根雙向發酵提取物的MEM基礎培養基（無FBS），設2個復孔，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。藥物作用48 h后收集細胞，0.25%胰酶消化，1000 r/min離心5 min，棄上清液，10%FBS的MEM完全培養基重懸細胞并調整細胞密度為2×105個/mL。將細胞接種于24孔板，每孔加1 mL，設3個復孔，37 ℃、5%C02飽和濕度培養箱培養4 h，吸出培養液，PBS洗3次，洗去未黏附細胞。甲醇固定20 min（或95%乙醇固定10 min），用0.1%結晶紫染色15～20 min，清水洗3次，風干，拍照，計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）=（對照組細胞黏附數-藥物干預組細胞黏附數）÷對照組細胞黏附數×100%]。實驗重復3次。

2.5 RT-PCR檢測MCF-7細胞細胞基質金屬蛋白酶-9和波形蛋白基因表達

將5×105個細胞接種于25 cm2培養瓶中，普通培養液培養過夜后，根據分組換用不同培養液繼續培養48 h后棄培養液。收集培養細胞，采用Trizol兩步法提取MCF-7細胞內的總RNA，測定OD260/OD280，計算總RNA純度和濃度。按試劑盒說明合成cDNA第1鏈，以此cDNA為模板進行PCR反應。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃（β-actin）、60.5 ℃（MMP-9）、56.4 ℃（Vimentin）退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環。72 ℃延伸5 min，4 ℃冷卻。取PCR產物進行瓊脂糖電泳，Gene Snap凝膠成像系統照相并進行灰度值分析，以條帶OD值代表其目的片段的表達量，以內參照β-actin的量校正，取二者OD值之比進行分析。每組實驗重復3次。引物信息見表1。

3 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 槐耳板藍根雙向發酵提取物對MCF-7細胞增殖的影響

各藥物處理MCF-7細胞48 h后，與對照組比較，細胞增殖能力被明顯抑制（P<0.05）；與槐耳組和板藍根組比較，槐耳板藍根組抑制作用更強（P<0.05）。結果見圖1。

4.2 槐耳板藍根雙向發酵提取物對MCF-7細胞遷移能力的影響

劃痕24 h后，對照組痕跡幾乎完全愈合，槐耳板藍根組和槐耳組痕跡愈合率均明顯下降，板藍根組作用不明顯，提示槐耳板藍根雙向發酵提取物具有明顯抑制細胞遷移的作用（P<0.05）。結果見圖2、圖3。

4.3 槐耳板藍根雙向發酵提取物對MCF-7細胞侵襲能力的影響

藥物作用48 h后，與對照組比較，各給藥組細胞侵襲能力明顯降低（P<0.05）；與板藍根組和槐耳組比較，槐耳板藍根組明顯抑制細胞侵襲能力（P<0.05）。結果見圖4、圖5。

4.4 槐耳板藍根雙向發酵提取物對MCF-7細胞黏附能力的影響

藥物作用48 h后，與對照組比較，各給藥組細胞黏附能力明顯降低（P<0.05）；與板藍根組和槐耳組比較，槐耳板藍根組明顯抑制細胞黏附能力（P<0.05）。結果見圖6、圖7。

5 討論

本研究選擇槐耳和板藍根進行雙向發酵研究除考慮微生物可能改變板藍根的物質基礎外，還包含了2味中藥的配伍思路，旨在研究現代炮制技術的同時探討其可能存在的中藥協同作用及兩者配伍的科學性。板藍根具有清熱解毒、抗炎消腫、涼血利咽之功；槐耳能治風、破血、益力，具有增強免疫作用。二者配伍可能具有扶正祛邪的協同作用。本實驗結果顯示，槐耳板藍根雙向發酵提取物抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖作用明顯優于2種藥物單獨干預，表明選擇槐耳和板藍根進行雙向發酵研究是可行有效的。

腫瘤的轉移和復發是癌癥患者死亡的重要原因之一，研究表明，MMP-9和MMP-2與腫瘤侵襲、轉移關系最密切，MMPs與乳腺癌及其他腫瘤轉移密切相關[8-9]。細胞外基質（ECM）是腫瘤轉移的天然屏障，腫瘤突破基底膜，進入ECM是癌癥發生遷移和侵襲的第一步。MMP分子中，MMP-9是分子量最大的酶，以酶原的形式分泌到胞外，MMP-9被激活后能夠降解和破壞腫瘤表面的ECM和基底膜，使癌細胞沿缺失的基底膜向周圍組織侵襲[10]。上皮細胞向間質細胞的轉變（EMT）是腫瘤轉移浸潤的一個關鍵步驟[11]。Vimentin是成纖維細胞中等纖維的主要構成成分之一，EMT發生時會使Vimentin表達水平顯著升高[12]。細胞劃痕實驗、Transwell小室體外侵襲實驗和細胞黏附實驗結果顯示，槐耳板藍根雙向發酵提取物可顯著抑制細胞愈合及其穿過基質膜的數量和細胞貼壁能力，表明槐耳板藍根雙向發酵提取物抑制MCF-7細胞的遷移和侵襲能力強于槐耳和板藍根、二者配伍雙向發酵具有更好的抗腫瘤細胞轉移侵襲的藥效作用。槐耳板藍根雙向發酵提取物可能通過抑制MMP-9和Vimentin基因表達抑制MCF-7細胞遷移和侵襲能力。

本實驗結果初步顯示，槐耳板藍根雙向發酵提取物可能通過抑制腫瘤細胞生長，調節某些遷移和侵襲相關因子的基因表達，減弱腫瘤細胞的侵襲力，從而發揮其抑制腫瘤的作用。提示中藥雙向發酵能夠增強藥物效果，比單獨用藥效果更好，符合中醫配伍增效減毒的理論，值得今后深入研究。

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