水稻顯性脆稈突變體Bc 18的鑒定和基因定位

彭應(yīng)財(cái)劉文真傅亞萍王鶴潼胡國(guó)成陳溫福徐正進(jìn)，＊

（1沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，沈陽(yáng)110866；2中國(guó)水稻研究所，杭州310006；＃共同第一作者；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：xuzhengjin＠126.com）

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水稻顯性脆稈突變體Bc 18的鑒定和基因定位

彭應(yīng)財(cái)1，2，＃劉文真2，＃傅亞萍2王鶴潼1胡國(guó)成2陳溫福1徐正進(jìn)1，＊

（1沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，沈陽(yáng)110866；2中國(guó)水稻研究所，杭州310006；＃共同第一作者；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：xuzhengjin＠126.com）

彭應(yīng)財(cái)，劉文真，傅亞萍，等.水稻顯性脆稈突變體Bc18的鑒定和基因定位.中國(guó)水稻科學(xué)，2016，30（2）：127－135.

摘 要：從三交組合Ⅱ－32B／／協(xié)青早B／Dular的F2群體中獲得了1個(gè)脆性突變體，整個(gè)植株表現(xiàn)全生育期脆性。根據(jù)該突變體的表型，將其命名為Bc18（Brittle culm 18）。為了更好地鑒定該突變體，用正常莖稈強(qiáng)度品種中9B作輪回親本與Bc18雜交，創(chuàng)制了Bc18脆稈近等基因系中脆B和中9B。表型鑒定顯示，突變體Bc18在生育期、株高、單株穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等主要農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀上與野生型中9B無(wú)顯著差別，但莖、葉的機(jī)械強(qiáng)度分別下降了70.70%和47.16%。細(xì)胞壁組分分析表明，突變體Bc18莖、葉的纖維素和木質(zhì)素含量與野生型中9B無(wú)顯著差異，但半纖維素含量分別提高了31.84%和17.35%。6個(gè)雜交組合F2和12個(gè)回交BC1F1群體的遺傳分析證明Bc18脆性突變由單顯性基因控制。采用圖位克隆技術(shù)，構(gòu)建了Bc18／02428和Bc18／9311的F2定位群體，并利用網(wǎng)上公布的SSR標(biāo)記和新設(shè)計(jì)的InDel標(biāo)記，最終將Bc18基因定位在第1染色體長(zhǎng)臂端InDel標(biāo)記PBC22與PBC33之間約154kb的區(qū)間內(nèi)。

關(guān)鍵詞：水稻；Bc18；顯性脆稈；機(jī)械強(qiáng)度；半纖維素含量；基因定位

水稻莖稈強(qiáng)度是一個(gè)非常重要的農(nóng)藝性狀，與水稻的抗倒伏、產(chǎn)量、米質(zhì)和品種的適應(yīng)性密切相關(guān)，是超級(jí)稻育種的重要考核指標(biāo)之一。水稻脆性突變，一方面導(dǎo)致莖稈機(jī)械強(qiáng)度顯著降低，影響水稻的抗倒伏性和栽培適應(yīng)性；另一方面，脆性突變導(dǎo)致莖葉細(xì)胞壁的組分改變和適口性增加，使其有望成為動(dòng)物飼料的原材料［1－2］，甚至成為提取生物能源乙醇的寶貴資源［3－4］。

水稻脆性突變體的研究始于20世紀(jì)60年代。自1963年Nagao等［5］首次報(bào)道水稻脆莖突變體bc1以來(lái)，已鑒定了20多個(gè)水稻脆性突變。，這些脆稈突變體大多數(shù)由隱性單基因控制，只有Bc6和nbc（t）由顯性基因控制，其中Bc6由半顯性單基因控制［6］，nbc（t）為雙顯性基因控制［7］。利用脆稈突變體，克隆了一系列脆稈相關(guān)基因。OsCesA4、OsC－esA7、OsCesA9編碼纖維素合酶催化亞基，在功能上并不冗余，可能形成一個(gè)纖維素合酶復(fù)合體參與次生細(xì)胞壁合成［8］。bc7與bc11是等位基因，均是由纖維素合酶基因OsCesA4突變產(chǎn)生［9－10］。fp2突變體為OsCesA7基因發(fā)生了錯(cuò)義突變，導(dǎo)致植株矮小，葉片披垂，機(jī)械強(qiáng)度明顯下降，生長(zhǎng)緩慢，纖維素減少了75%，木質(zhì)素減少了68%，半纖維素和硅質(zhì)則增加了31%和30%［11］。Bc6、bc88、dwf1、S1－60 和bc13為等位基因，均是OsCesA9基因發(fā)生了突變，其中Bc6在第7外顯子的高度保守區(qū)發(fā)生了錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第588個(gè)氨基酸由精氨酸變?yōu)榱涟彼幔o稈纖維素含量降低了38%，半纖維素含量增加了34%［6］；bc88在第5外顯子的第1784位點(diǎn)發(fā)生堿基代換，錯(cuò)義突變導(dǎo)致第421個(gè)氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼幔仓臧砻缙谌~片萎蔫，生育期延遲，根短，分蘗減少，莖稈纖維素含量只有野生型的60%（鮮質(zhì)量）［12－13］；dwf1在第7外顯子上產(chǎn)生的錯(cuò)義突變，導(dǎo)致植株變矮，葉片披垂，纖維素和木質(zhì)素含量下降，半纖維素含量增加，葉片機(jī)械強(qiáng)度下降了83%［14］；S1－60在第5跨膜區(qū)域發(fā)生的錯(cuò)義突變，導(dǎo)致植株矮化、育性下降，纖維素含量只有野生型的44.7%，機(jī)械強(qiáng)度下降［15］；bc13則在第551位點(diǎn)發(fā)生了錯(cuò)義突變（G變?yōu)锳），編碼的氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼幔挥贜－末端鋅指之后富含酸性氨基酸殘基區(qū)域，導(dǎo)致植株機(jī)械強(qiáng)度只有野生型的1／3，細(xì)胞壁變薄，纖維素含量比野生型降低了22%，部分維管束木質(zhì)部坍塌或?qū)Ч軘?shù)量變多但大小不均勻，地上部分鎘（Cd）積累減少，耐鎘能力增強(qiáng)［16］。BC1基因編碼一個(gè)主要在水稻的厚壁組織和維管束中表達(dá)的類－cobra蛋白，與纖維素微纖絲的組裝和纖維素結(jié)晶密切相關(guān)，BC1基因突變不僅可以降低細(xì)胞壁厚度和纖維素含量，還增加了木質(zhì)素的含量［17－18］。BC3基因編碼OsDRP2B蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的跨膜運(yùn)輸，影響纖維素合酶OsCesA4在質(zhì)膜上的豐度，BC3基因突變干擾了細(xì)胞壁纖維素的合成，導(dǎo)致植株根、莖、葉纖維素含量降低了28%～36%［19－20］。BC10基因編碼一個(gè)定位在高爾基體的Ⅱ型內(nèi)整合膜蛋白，具有糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁纖維素合成和阿拉伯半乳聚糖蛋白含量，控制水稻的機(jī)械強(qiáng)度［21］。BC12基因編碼一個(gè)馬達(dá)蛋白kinesin4，這是一個(gè)雙靶向定位蛋白，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，參與次生細(xì)胞壁的生物合成和細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞數(shù)目顯著減少導(dǎo)致了突變體植株矮化，纖維素微纖絲排列異常和細(xì)胞壁組分改變導(dǎo)致脆性突變［22］。BC14與OsNST1是等位基因，編碼一個(gè)具有尿苷二磷酸－葡萄糖（UDP－Glucose）轉(zhuǎn)運(yùn)活性的核糖轉(zhuǎn)運(yùn)子（NSTs），該轉(zhuǎn)運(yùn)子定位于高爾基體內(nèi)，調(diào)控細(xì)胞壁多糖生物合成過程中底物的跨膜運(yùn)輸，參與細(xì)胞壁多糖及糖蛋白構(gòu)建［23－24］。BC14／OsNST1基因的錯(cuò)義突變引起纖維素含量下降，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致植株機(jī)械強(qiáng)度降低和生長(zhǎng)發(fā)育缺陷。BC15／OsCTL1基因編碼一個(gè)定位在高爾基體上Ⅱ型跨膜類幾丁質(zhì)酶蛋白，錯(cuò)義突變引起厚壁組織細(xì)胞壁變薄和纖維素含量降低，機(jī)械強(qiáng)度嚴(yán)重下降，但生長(zhǎng)發(fā)育未受到顯著影響［25］。Li等［26］通過T－DNA插入水稻突變體庫(kù)，篩選到了一個(gè)軟稈脆莖突變體fc1，植株變矮（株高只是野生型的80%），莖稈軟且不能直立，結(jié)實(shí)率和千粒重下降，生育期延長(zhǎng)，第1、2節(jié)間的機(jī)械強(qiáng)度降低到野生型的34%～28%，纖維素含量為野生型的86%，木質(zhì)素含量為野生型的82%，F(xiàn)C1編碼一個(gè)肉桂醇脫氫酶，主要在厚壁組織的次生細(xì)胞壁和維管束中表達(dá)。此外，已染色體定位但還有待克隆或確定功能的脆性基因有位于第2染色體的dfr［27］、dbc1［28］，位于第5染色體的bc2［29－30］，位于第6染色體的bc4［31］、734［32］，位于第9染色體的ncb（t）［7］、fld1［33］等。這些研究結(jié)果表明，水稻植株表現(xiàn)脆性主要是由細(xì)胞壁組分（特別是纖維素含量降低）或結(jié)構(gòu)發(fā)生變化引起的，細(xì)胞壁形成過程中的某一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均有可能導(dǎo)致脆性突變的產(chǎn)生。

本研究從新品種選育過程中三交組合Ⅱ－32B／／協(xié)青早B／Dular的F2群體獲得一個(gè)莖、葉、穗和種子均表現(xiàn)脆性的突變體Bc18，通過農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀、細(xì)胞壁組分、莖葉機(jī)械強(qiáng)度等方面的研究揭示了Bc18突變體的生物學(xué)特性，并利用圖位克隆技術(shù)對(duì)Bc18進(jìn)行基因定位，旨在為克隆該基因和研究顯性脆稈水稻的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為谷草兩用脆稈雜交稻新品種培育提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在三交組合Ⅱ－32B／／協(xié)青早B／Dular的F2群體中發(fā)現(xiàn)一個(gè)脆稈單株，通過連續(xù)10代自交選擇后獲得了水稻脆性突變體。根據(jù)突變體的表型，將該突變體命名為Bc18（Brittle culm 18）。

因突變體Bc18來(lái)源于三交組合Ⅱ－32B／／協(xié)青早B／Dular，三交組合的各個(gè)親本與突變體Bc18均有一定的親緣關(guān)系，但卻不適合作為突變體的野生型用于對(duì)比。因此，用Bc18作為脆性基因供體，中9B作為受體和輪回親本創(chuàng)制了該脆稈性狀的近等基因系中脆B（Bc18）和中9B。突變體和野生型植株如無(wú)特別說(shuō)明均來(lái)自該近等基因系。

1.2 農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量構(gòu)成調(diào)查

2008－2009年，結(jié)合脆稈雜交稻配合力比較試驗(yàn)，調(diào)查突變體Bc18及其野生型中9B的主要農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每區(qū)組設(shè)置11個(gè)小區(qū)，重復(fù)3次，每小區(qū)種植10行，每行15株，行株距20cm×27cm，單本插。記載各個(gè)小區(qū)的生育期，成熟期從小區(qū)第3行、第3株開始調(diào)查連續(xù)10個(gè)單株的株高、單株有效穗數(shù)，再按10個(gè)調(diào)查單株的單株平均有效穗數(shù)取樣2株考查穗長(zhǎng)、每穗總粒數(shù)、實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重，每小區(qū)實(shí)割測(cè)產(chǎn)110株。

1.3 植株機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定

分別挖取成熟期突變體Bc18和野生型中9B 各3～5株，挑選沒有病蟲害、粗細(xì)比較接近的莖稈各10個(gè)，取倒2節(jié)間上部約12cm長(zhǎng)的莖稈片段放在WZL－300B臥式電腦拉力儀上進(jìn)行抗張力測(cè)試，參數(shù)設(shè)定如下：ω＝0.05g／m2；夾距＝50mm；速度v＝10mm／min，在顯示器上讀取抗張力數(shù)值（牛，N）。按同樣的測(cè)試方法，取健康無(wú)病的倒2葉10片，在靠近葉片基部總長(zhǎng)度的1／3處取12cm長(zhǎng)的葉片放在電腦拉力儀上測(cè)定葉片的抗張力。以抗張力的測(cè)定值代表測(cè)試樣品的機(jī)械強(qiáng)度。

1.4 細(xì)胞壁組分分析

取抽穗期的葉片與莖稈，105℃下殺青1h，然后65℃下烘24h，粉碎后過40目篩，裝入樣品袋備用。采用Van Soest法測(cè)定細(xì)胞壁組分含量的技術(shù)原理［34］，利用丹麥FOSS公司生產(chǎn)的Fibertec 2010型纖維素測(cè)定儀測(cè)定樣品的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量。

1.5 脆稈突變體Bc18的遺傳

選用3個(gè)秈稻保持系（中9B、Ⅱ－32B、協(xié)青早B）和3個(gè)恢復(fù)系（明恢63、密陽(yáng)46、中恢218），分別與原始突變體Bc18進(jìn)行雜交及回交，建立F2群體和BC1F1回交群體。采用超稀直播法播種，每個(gè)F2群體播種2000～3000粒，回交群體播種200～300粒。出苗后大約2葉1心時(shí)，對(duì)2粒谷挨在一起或過密之處的單株進(jìn)行間苗。在群體絕大部分單株成熟時(shí)，采用人工折斷法進(jìn)行脆與非脆單株的鑒定。

1.6 Bc18脆稈基因分子定位

1.6.1 構(gòu)建定位群體

用原始突變體Bc18分別與粳稻品種02428和秈稻品種9311雜交建立F2群體。采用人工折斷法，抽穗期進(jìn)行第一次植株脆性鑒別，成熟期進(jìn)行第二次脆性確認(rèn)，兩次鑒別均表現(xiàn)野生型（02428或9311）的非脆稈單株用于Bc18基因的定位。

1.6.2 水稻總DNA的提取和PCR檢測(cè)分子標(biāo)記的多態(tài)性

參照盧揚(yáng)江和鄭康樂的方法，稍作修改后提取水稻DNA［35］。PCR體系包括20ng／μL模板DNA 2μL，1μmol／L SSR引物2μL，10×PCR緩沖液1.5μL，1μmol／L dNTP 0.8μL，5U／μL Taq酶0.3μL，ddH2O 8.4μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃下預(yù)變性5min；94℃下變性1min，55℃～58℃下退火1min，72℃下延伸1min，35個(gè)循環(huán)；再在72℃下延伸10min。PCR產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法顯色后直接觀察分子標(biāo)記的多態(tài)性。

1.6.3 Bc18脆稈基因的定位

選取均勻分布在水稻12條染色體上的256對(duì)SSR引物，對(duì)野生型親本02428、9311分別與原始突變體Bc18進(jìn)行多態(tài)性分析。根據(jù)兩親本間分子標(biāo)記的多態(tài)性，確定用于基因定位的分子標(biāo)記和F2群體。在確定Bc18基因在染色體上的位置后，將國(guó)際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃完成的日本晴基因組序列和中國(guó)華大基因研究中心完成的9311草圖序列作BLAST分析（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／Genome／PlantBlast.shtml），找出日本晴和9311之間的差異序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)新的InDel引物。利用新設(shè)計(jì)的引物和更多的定位單株，通過染色體步移最終確定Bc18基因所在的區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體Bc18及其近等基因系的獲得與純化

在雜交水稻三系不育系的選育過程中，從三交組合Ⅱ－32B／／協(xié)青早B／Dular的F2群體中發(fā)現(xiàn)一個(gè)莖稈、稻穗容易斷裂的單株，后代繁種出現(xiàn)莖稈脆與不脆分離。從中選擇莖稈表現(xiàn)最脆，株葉形態(tài)較好的單株留種。經(jīng)過連續(xù)10代自交加代和人工選擇，獲得一個(gè)谷殼金黃色，莖、葉、穗和種子很容易折斷的單株群體，根據(jù)突變體的表型將其命名為Bc18（曾用名：ZGBCR1）。

以Bc18作為脆性基因供體，正常莖稈強(qiáng)度的秈稻保持系中9B作為受體和輪回親本，雜交后再連續(xù)回交3次，獲得了Bc18脆稈性狀的近等基因系中脆B（Bc18）和中9B（野生型），并以此近等基因系進(jìn)行突變體Bc18相關(guān)性狀的鑒定。

2.2 突變體Bc18的主要農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀

突變體Bc18田間表現(xiàn)與野生型相似。兩者播始?xì)v期相同，株高也十分接近。突變體的莖粗（莖稈外徑）略小于野生型，但稈壁的厚度較野生型稍大；突變體的葉片略長(zhǎng)于野生型，但葉片變窄、葉厚增加。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，所有這些性狀在突變體和野生型之間均無(wú)顯著差異（表1）。

連續(xù)兩年三次重復(fù)區(qū)組比較試驗(yàn)，突變體Bc18的單株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、穗長(zhǎng)、著粒密度與野生型基本一致；結(jié)實(shí)率略高于野生型，千粒重比野生型略低，但差異不顯著；實(shí)測(cè)小區(qū)產(chǎn)量?jī)烧邲]有明顯差異（表2）。

表1 突變體Bc18及其野生型的主要特征特性（2008年，杭州）Table 1.Major agronomic traits of Bc18 and its wild type in Hangzhou，2008.

表2 突變體Bc18與及其野生型的產(chǎn)量與產(chǎn)量構(gòu)成（2008－2009年，杭州）Table 2.Yields and yield components of Bc18 and its wild type in Hangzhou，2008－2009.

以上結(jié)果說(shuō)明，Bc18脆性突變對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育沒有明顯影響，農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀沒有變劣。

A、B、C和D分別為突變體Bc18易折斷的莖稈、葉片、葉鞘和稻穗；箭頭表示突變體Bc18各個(gè)部分易斷裂之處。A，B，C and D show broken culm，leaf，leaf sheath and panicle of Bc18，respectively；Arrows indicate easily broken position of Bc18；WT，Wild type.圖1 突變體Bc18和野生型的表型Fig.1.Phenotypes of Bc18 and its wild type.

10個(gè)測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值；＊＊表示在0.01水平上差異顯著；橫欄表示標(biāo)準(zhǔn)誤。The average values are means of 10measurements；＊＊significant at 0.01level；Bars are standard errors；WT，Wild type.圖2 突變體Bc18和野生型的機(jī)械強(qiáng)度Fig.2.Mechanical strength of Bc18 and its wild type.

2.3 突變體Bc18的機(jī)械強(qiáng)度

突變體Bc18植株表現(xiàn)全生育期脆性，莖、葉片、葉鞘、穗都很容易折斷，機(jī)械強(qiáng)度明顯下降（圖1）。采用人工折斷的方法雖然可以對(duì)稻株的機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行大致定性，卻難以進(jìn)行精確的定量分析。為此，我們利用WZL－300B臥式電腦拉力儀測(cè)定了Bc18及其野生型中9B成熟期倒2節(jié)間和倒2葉的抗張力，結(jié)果表明突變體Bc18倒2節(jié)間和倒2葉的抗張力分別為19.89N和10.44N，分別比野生型降低了70.70%和47.16%（圖2）。可見，脆性突變嚴(yán)重影響了Bc18植株的機(jī)械強(qiáng)度。

2.4 突變體Bc18的細(xì)胞壁組分

測(cè)定成熟期突變體Bc18和野生型中9B莖稈和葉片的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量，結(jié)果表明，突變體Bc18莖、葉的纖維素含量各占莖、葉干物質(zhì)總質(zhì)量的28.93%和18.8%，與野生型接近；半纖維素含量各占干物質(zhì)總質(zhì)量的26.5%和35.0%，分別比野生型提高了31.84%和17.35%，差異極顯著；木質(zhì)素含量各占莖、葉干物質(zhì)總質(zhì)量的3.23%和4.5%，比野生型提高了3.19%和5.15%，差異不顯著（圖3）。這與已發(fā)表的大多數(shù)脆性突變體纖維素含量明顯降低不同。

2.5 Bc18脆稈性狀的遺傳

用原始突變體Bc18與3個(gè)秈稻保持系和3個(gè)秈稻恢復(fù)系分別雜交獲得F1植株，所有F1植株莖、葉都表現(xiàn)脆性；6個(gè)F2群體，莖稈表現(xiàn)脆和非脆的單株數(shù)呈現(xiàn)典型的3∶1分離，經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)，符合一對(duì)顯性單基因控制的遺傳模式（表3）。以突變體Bc18作輪回親本建立的6個(gè)BC1F1回交群體，全部植株均表現(xiàn)脆性；以正常莖稈強(qiáng)度親本作輪回親本建立的6個(gè)BC1F1回交群體，脆與非脆單株以1∶1分離，進(jìn)一步證明了Bc18突變體受單顯性基因控制。

A－莖稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量；B－葉片纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量。3個(gè)測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值；＊＊表示在0.01水平上差異顯著；橫欄表示標(biāo)準(zhǔn)誤。A and B，Cellulose，hemicellulose and lignin contents of total cell wall residues of the culm（A）and leaf（B）segments fromBc18 and its wild type plants；The average values are means of 3measurements；＊＊significant at 0.01level；The bars refer standard errors.圖3 突變體Bc18和野生型細(xì)胞壁組分含量Fig.3.Measurement of cell wall components of Bc18 and its wild type.

2.6 Bc18脆稈基因的染色體定位

多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果顯示，256對(duì)SSR引物中有102對(duì)在Bc18和02428之間具有多態(tài)性。利用篩選獲得的多態(tài)SSR引物檢測(cè)Bc18／02428F2定位群體中9個(gè)野生型（不脆）單株的基因型，結(jié)果顯示第1染色體長(zhǎng)臂端的分子標(biāo)記RM7419顯示的9個(gè)野生型單株的基因型與親本02428完全相同。擴(kuò)大樣本到21個(gè)野生型單株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bc18脆稈基因與RM7419標(biāo)記之間僅存在1次交換（圖4）。通過以上實(shí)驗(yàn)初步將Bc18定位在第1染色體長(zhǎng)臂端分子標(biāo)記RM7419附近。

2.7 Bc18脆稈基因的精細(xì)定位

表3 突變體Bc18 F2分離群體Table 3.Genetic analyses of Bc18 F2populations.

在初定位的基礎(chǔ)上，我們根據(jù)Gramene（http：／／www.gramene.org）網(wǎng)站上提供的數(shù)據(jù)，在RM7419標(biāo)記附近挑選了10對(duì)SSR引物。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示只有SSR標(biāo)記RM315在Bc18與02428之間具有多態(tài)性。利用RM7419和RM315引物檢測(cè)21個(gè)野生型單株的基因型，發(fā)現(xiàn)RM7419 和RM315與Bc18均有1個(gè)交換，但是交換單株不同，因此Bc 18基因被定位在SSR標(biāo)記RM7419和RM315之間。繼續(xù)在RM7419和RM315標(biāo)記之間尋找和合成新的SSR引物，通過134個(gè)定位單株把Bc18基因進(jìn)一步定位在SSR標(biāo)記RM1231和RM265之間大約5.7Mb的區(qū)間內(nèi)。

為了對(duì)Bc18基因做進(jìn)一步的定位，根據(jù)RM1231和RM265之間水稻品種9311和日本晴的基因組序列差異，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了5對(duì)InDel引物，多態(tài)性分析顯示，只有1對(duì)引物在02428和Bc18之間表現(xiàn)出多態(tài)性，卻有4對(duì)引物在9311和Bc18之間表現(xiàn)出多態(tài)性，且?guī)颓逦Ｒ虼耍?xì)定位群體改為9311／Bc18 F2群體中的非脆單株。通過1011個(gè)定位單株，把Bc18基因定位在InDel標(biāo)記PBC4與PBC25之間，物理圖距為460kb的區(qū)域內(nèi)。然后又在PBC4與PBC25之間新設(shè)計(jì)了4個(gè)有多態(tài)的InDel標(biāo)記（表4）。用這4對(duì)InDel引物進(jìn)一步將Bc18基因定位在InDel標(biāo)記PBC22與PBC33之間大約154kb的物理圖距內(nèi)（圖5）。

1－Bc18；2－02428；3－F1（02428×Bc18）；4～24－F2不脆單株。Lane 1，Bc18；Lane 2，02428；Lane 3，F(xiàn)1（02428／Bc18）；Lanes 4to 24，Non－brittle culm individuals in F2population.圖4 與Bc18基因連鎖的SSR標(biāo)記RM7419的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4.Electrophoresis of the SSR marker RM7419linked with the Bc18 locus.

3 討論

圖5 Bc18基因在第1染色體上的位置Fig.5. Location of the Bc18 gene on the chromosome 1of rice.

表4 用于Bc18基因精細(xì)定位的分子標(biāo)記Table 4.Markers used for fine mapping of the Bc18 gene.

3.1 突變體Bc18的表型比較

從已報(bào)道的脆稈突變體來(lái)看，除了莖葉比較脆嫩、植株機(jī)械強(qiáng)度顯著下降之外，大多數(shù)脆性突變體還伴隨著諸如植株矮化、葉片披垂、卷葉、生育期延遲、穗變小、結(jié)實(shí)率下降等多種效應(yīng)。例如，bc3、bc10、bc11、bc12、bc14、NE1031、ND8759、ND2359、bc88等突變體植株變矮，bc11、fp2、bc88、NE1031、ND8759、ND2359、dwf1等突變體成熟期葉片下垂，突變體fc 1莖稈不能直立，bc 3、bc10、bc11、bc12、gdd1、bc14、NE1031等突變體表現(xiàn)分蘗少、根短、結(jié)實(shí)率下降、葉片萎蔫等性狀。本研究獲得的突變體Bc18株葉形態(tài)良好，農(nóng)藝、產(chǎn)量性狀、生育期與野生型接近。

細(xì)胞壁組分測(cè)定結(jié)果表明，脆稈突變體的纖維素含量基本都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，半纖維素含量有升有降，木質(zhì)素含量升高的突變體較多。半顯性脆稈突變體Bc6莖稈纖維素含量比野生型降低了38%，半纖維素含量增加了34%，木質(zhì)素含量沒有明顯變化［6］；nbc（t）突變體莖稈纖維素含量比野生型下降了17%，木質(zhì)素含量提高了5%，莖稈抗張力下降了69%［7］。與這些突變體相比，Bc18莖、葉的纖維素含量基本不變，木質(zhì)素含量變化也不大，而半纖維素含量顯著提高了31.84%和17.35%，莖稈機(jī)械強(qiáng)度比野生型下降了約70%，葉片機(jī)械強(qiáng)度則下降了47%。只有半纖維素含量顯著提高是Bc18脆稈突變體在細(xì)胞壁組分上與其他脆稈突變體的明顯不同之處。

3.2 Bc18突變基因的探討

在已報(bào)道的脆稈突變體中，大部分是隱性單基因控制，只有bc6、nbc（t）為顯性基因控制，其中bc6是一個(gè)半顯性基因，位于第9染色體，是纖維素合酶OsCesA9基因發(fā)生了突變［6］；nbc（t）則可能是由雙顯性基因控制，也位于第9染色體［25］。從本研究結(jié)果來(lái)看，Bc18由單顯性基因控制，位于第1染色體的長(zhǎng)臂端。

目前，第1染色體上報(bào)道了3個(gè)脆稈突變體bc7、bc11和NE1031，它們均是纖維素合酶OsCesA4基因發(fā)生了突變引起的。基因克隆分析發(fā)現(xiàn)，bc7在OsCesA4基因的第10外顯子和第10內(nèi)含子的連接處缺失了7個(gè)堿基，移碼突變導(dǎo)致不能產(chǎn)生正常功能的OsCesA4蛋白，纖維素含量降低了約10%，半纖維素提高了30%，木質(zhì)素含量沒有明顯變化，細(xì)胞壁變薄、機(jī)械強(qiáng)度下降，但外形沒有明顯變化［9］；bc11是在OsCesA4基因的第13外顯子上的一個(gè)堿基發(fā)生了錯(cuò)義突變，突變位點(diǎn)位于非常保守的第5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的末端，G858R位置氨基酸由亮氨酸變?yōu)榫彼幔仓臧⑷~片萎蔫、穗變小、成熟期葉片披垂，細(xì)胞壁變薄，纖維素含量比野生型降低了約60%，阿拉伯木糖顯著增加，木質(zhì)素含量變化很少［10］；NE1031是在OsCesA4基因的第6外顯子處插入了Tos17轉(zhuǎn)座子，導(dǎo)致基因產(chǎn)生突變，植株矮小，葉片萎蔫，莖稈變細(xì)，結(jié)實(shí)率低，纖維素含

量比野生型下降了80%左右，細(xì)胞壁變薄［8］。基因預(yù)測(cè)和功能注釋結(jié)果表明，Bc18所在的154kb區(qū)間內(nèi)有23個(gè)ORF，其中包含了OsCesA4基因（LoC ＿Os01g54620）。到底Bc18是不是與bc7、bc11、NE1031一樣，因OsCesA4基因突變產(chǎn)生了脆性，還有待于進(jìn)一步研究，但本研究的精細(xì)定位結(jié)果對(duì)進(jìn)一步克隆Bc18基因奠定了基礎(chǔ)。

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Characterization and Gene Mapping of a Dominant Brittle Culm Mutant Bc 18in Rice（Oryza sativa L.）

PENG Ying－cai1，2，＃，LIU Wen－zhen2，＃，F(xiàn)U Ya－ping2，WANG He－tong1，HU Guo－cheng2，CHEN Wen－fu1，XUZheng－jin1，＊
（1College of Agronomy，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；2 China National Rice Research Institue，Hangzhou 310006，China；＃These authors contributed equally to this work；＊Corresponding author，E－mail：xuzhengjin＠126.com）

PENG Yingcai，LIU Wenzhen，F(xiàn)U Yaping，et al.Characterization and gene mapping of a dominant brittle culm mutant Bc18 in rice（Oryza sativa L.）.Chin J Rice Sci，2016，30（2）：127－135.

Abstract：A brittle culm mutant was obtained from the F2population of three－way crossⅡ－32B／／Xieqingzao B／Dular and named as Brittle culm 18（Bc18）according to its phenotypes.Each part of plant showed brittleness during the whole growth period.In order to identify the mutant，near isogenic line populations of Zhongcui B and Zhong 9Bwere created with Bc18 mutant as the donor of brittle gene and Zhong 9B，a normal culm－strength variety，as the receptor and recurrent parent.Compared with wild type，Bc18 significantly declined by 70.70%and 47.16%in mechanical strength of culm and leaves，respectively.No significant differences were found in terms of growth duration，plant height，panicle number per plant，spikelet number per panicle，seed setting rate and 1000－grain weight.Cell wall components analyses showed that cellulose content and lignin content in Bc18 had no significant difference as compared with those of wild type，while hemicellulose content in culm and leaf dramatically increased by 31.84%and 17.35%，respectively.Genetic analyses of six F2and twelve BC1F1backcross populations revealed that the phenotype of Bc18 was controlled by a single dominant gene.Bc18／02428and Bc18／9311F2populations were developed for Bc18 gene mapping.By means of map－based cloning technology，with some SSR markers published online and new designed InDel markers，Bc18 was localized between InDel marker PBC22and PBC33at a physical distance of about 154kb on the long arm of chromosome 1.This work laid the foundation for cloning Bc18 gene in the future.

Key words：rice（Oryza sativa L.）；Bc18；dominant brittle culm；mechanical strength；hemicellulose content；gene mapping

中圖分類號(hào)：Q343.5；S511.032

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001－7216（2016）02－0127－09

基金項(xiàng)目：中央級(jí)科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2014RG001－5）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院超級(jí)稻雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（CAAS－ASTIP－2013－CNRRI）。

收稿日期：2015－11－02；修改稿收到日期：2015－11－22。