一個水稻白化致死突變基因的精細定位和遺傳研究

初志戰劉小林陳遠玲劉耀光，＊

（1華南農業大學生命科學學院／亞熱帶農業生物資源保護與利用重點實驗室，廣州510642；2江西宜春學院，江西宜春336000；＊通訊聯系人，E－mail：ygliu＠scau.edu.cn）

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一個水稻白化致死突變基因的精細定位和遺傳研究

初志戰1劉小林2陳遠玲1劉耀光1，＊

（1華南農業大學生命科學學院／亞熱帶農業生物資源保護與利用重點實驗室，廣州510642；2江西宜春學院，江西宜春336000；
＊通訊聯系人，E－mail：ygliu＠scau.edu.cn）

初志戰，劉小林，陳遠玲，等.一個水稻白化致死突變基因的精細定位和遺傳研究.中國水稻科學，2016，30（2）：136－142.

摘 要：從粳稻品種日本晴經(60)Co誘變的M1代材料中發現了一個白化致死突變體，該突變體從萌芽后一直表現白化，3葉期后逐漸衰亡。遺傳分析表明，該突變表型受一對隱性核基因控制，將該白化突變體暫定名為al14。與野生型相比，al14突變體的葉綠素含量與類胡蘿卜素含量顯著降低。電子顯微鏡觀察表明al14突變體不能形成完整的葉綠體，只有原片層體結構。對葉綠體編碼基因的表達分析發現，突變體中光系統Ⅰ和光系統Ⅱ基因表達明顯下調，核糖體結構基因和質體編碼的RNA聚合酶亞基基因表達明顯上調，但是PsbN（photosystemⅡprotein N）卻上調表達水平最高，達到118.23倍。利用al14突變體與黃華占雜交獲得的F2代分離群體進行基因定位，將該基因定位于水稻第6染色體上約40kb的范圍。目前，該范圍內沒有葉色相關基因的報道，可能為一新的調控葉綠體發育的基因。

關鍵詞：水稻；白化致死；基因定位

水稻是世界上三大糧食作物之一，也是研究植物功能基因的模式作物。水稻的物質產量大部分來源于葉片的光合作用，因此葉片的顏色、大小和形狀直接影響水稻的產量和品質。水稻的葉色突變較為常見，大多數的葉色突變都會導致葉綠體中葉綠素a，葉綠素b及類胡蘿卜素等色素含量改變，引起植株光合作用效率下降，進而導致植株生長緩慢，株型弱小，結實率下降，甚至植株死亡。葉綠體是半自主型細胞器，其生物發生及發育是受核基因組和葉綠體基因組共同調控，所以核基因或葉綠體基因的突變都有可能會影響到葉綠體的正常發育，因此，研究葉色調控不僅可以深入研究葉綠體的形成發育過程，也可以從分子水平對水稻株型改良，尤其是葉色的改良及水稻的高產提供選擇。

迄今為止，已報道的水稻葉色突變體超過180個，大多數定位到染色體的特定區間（超過140個），已成功克隆的葉色相關基因有37個。從葉色突變基因的分布來看，突變基因在12條染色體上均有發現，第3染色體上最多。在已報道的水稻葉色突變體中，大多數為單基因控制的隱性突變體；黃化突變基因，返綠型突變基因和白化突變基因較多，其中白化突變基因目前已報道的超過28個。引起葉色變異的機理較多，其中參與葉綠素、類胡蘿卜素等色素合成過程中的酶發生突變，導致葉綠素合成缺陷，是目前發現的最多的一類。OsCAO1（水稻葉綠素a加氧酶）是催化葉綠素a合成葉綠素b的關鍵酶，該酶失活會導致水稻葉片黃化、植株矮化［1］。YGL1［2］編碼葉綠素合酶，催化葉綠素酸酯a形成葉綠素a，突變體表型為黃綠。OsDVR（Oryza sativa divinyl reductase，水稻二乙烯還原酶），催化二乙烯葉綠素（酸酯）a轉化為單乙烯葉綠素（酸酯）a，突變后水稻葉色黃綠，植株矮小［3］。OsPDS（水稻八氫番茄紅素脫氫酶）、OsZDS（水稻ζ－胡蘿卜素脫氫酶）、OsCRTISO（水稻類胡蘿卜素異構酶）、β－OsLCY（水稻番茄紅素β－羥化酶）這4個酶都參與類胡蘿卜素前體－ABA的合成，任何一個發生突變均可導致突變體中ABA含量下降，引起穗萌和白化［4］。葉綠體自身結構發育異常也常常導致葉色的突變，Kusumi等［5］在轉綠型白葉突變體v1中發現，核基因組編碼的葉綠體RNA聚合酶蛋白OsRpoTp表達量急劇減少，導致葉綠體發育不良，是造成早期葉色白化的主要原因。Sumimoto等［6］發現葉綠體不良的轉綠型白葉突變體v2也屬于此類型。Gothandam等［7］發現葉綠體發育相關的基因OsPPR1表達水平降低會導致水稻葉片白化。Zhao等［8］發現OsCHR4參與了水稻近軸葉肉細胞葉綠體早期分化，其功能的喪失阻礙近軸葉肉細胞葉綠體的發育，所以OsCHR4突變體表現葉片近軸部白化。葉綠素分解代謝障礙也可以導致葉色突變，大多突變表型為葉色常綠。Jiang等［9－11］發現基因Sgr可能參與調控PaO脫鎂葉綠酸a加氧酶活性，Sgr可與LHCPⅡ（捕光葉綠素a／b結合蛋白Ⅱ）結合，在類囊體膜上形成Sgr－LHCPⅡ復合物，誘導LHCPⅡ降解，促使葉綠素的降解，其突變體表現出葉片滯綠。NYC1（Non－yellow coloring）［12］編碼葉綠素b還原酶，該酶是葉綠素降解過程中的第1個酶，突變可引起葉綠體基粒和捕光系統Ⅱ退化減慢，葉片常綠。

本實驗室利用60Co誘變日本晴，M1代獲得一個水稻白化致死突變體，將該白化突變體暫命名為al14。遺傳分析表明，該性狀是由單個隱性基因控制的。本研究對該突變體進行生理生化分析和顯微觀察，并對該突變基因進行了精細定位，以期為該基因的克隆及對葉綠體發育過程的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 突變體材料

白化致死突變體來源于水稻日本晴（粳稻品種）的60Co輻射誘變M1代。由于突變體苗期白化致死，因此M1代表型正常植株單株掛牌，單株收種保存。播種M2代種子，可以分離出白化苗的株系，單株收種，田間材料按常規管理。

1.2 葉綠素含量測定

分別取3葉期前期突變體和野生型材料的葉片，測定其葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量，重復3次，取平均值。測定方法參照文獻［13］，并略加修改。

1.3 葉綠體顯微結構觀察

取播種12d的野生型及突變體葉片，用4%戊二醛（用pH7.2的磷酸緩沖溶液配置）4℃固定過夜，磷酸緩沖溶液沖洗3次，1%鋨酸固定1h，磷酸緩沖溶液沖洗3次，用30%、50%、70%、80%、95%、100%的乙醇和丙酮逐級脫水5min，最后用樹脂包埋樣品，切片后用醋酸鈾染色，再用透射電鏡進行觀察。

1.4 定位群體的構建

選取苗期能夠分離出白化突變體的M2株系（上一代為雜合單株），隨機選取6株生長正常的單株，分別與秈稻品種黃華占雜交，獲得F1種子。播種F1后，自交繁殖獲得F2種子，單株收種。分株系種植F2代，以能分離出白化苗的F2群體為定位群體。

1.5 基因定位

基因初步定位：采用SDS法［14］提取20株白化苗葉片總DNA用于基因定位。基因精細定位：根據初步定位結果，采用快速打葉法［15］對定位群體植株進行兩側標記檢測，并利用內部InDel引物進一步縮小定位區間。

A－秧苗；B－葉片。A－Seedling；B－Leaf.圖1 突變體al14及其野生型（WT）的表型Fig.1.Phenotypes of al14 and its wild type（WT）.

本研究用于基因定位的分子標記為InDel標記：一部分為本實驗室已有的，另一部分為根據已公布的水稻品種93－11和日本晴全基因組序列自行開發。這些標記均勻分布于水稻12條染色體，共147對。

1.6 葉綠體基因表達分析

取2葉期的葉片提取RNA，反轉錄成cDNA，利用β－Actin（Os03g0718100）（F：CACATTCCAGC AGATGTGGA；R：ACCACAGGTAGCAATAGG TA）作為內參基因，64對引物檢測突變體中葉綠體基因組基因的表達量。根據BioRad公司的《熒光定量PCR應用指南》所述，進行數據處理，通過計算2－△△Ct值來確定每個基因在野生型和突變體中的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 突變體表型鑒定

正常的自然條件下，al14種子萌發后，子葉為白色，從真葉長出至3葉期，葉片完全為白色，3葉期后，逐漸死亡（圖1）。

表1 突變體al14及其野生型中色素含量Table 1.Photosynthetic pigments contents in al14 and its wild type.

1－葉綠體；2－類囊體；3－原片層體。1，Chloroplast；2，Thylakoid；3，Prolamellar body.圖2 野生型（A，C）和al14突變體（B，D）的超微結構Fig.2.Transmission electron microscopy observation of wild type（A，C）and al14 mutant（B，D）.

2.2 突變體的葉綠素含量變化

通過測定突變體al14及其野生型葉片的葉綠素、類胡蘿卜素的含量，發現al14的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜含量明顯下降，與野生型相比均差異顯著，表明al14的葉綠素合成受到明顯抑制（表1）。

2.3 葉綠體的顯微結構

利用透射電鏡觀察al14及其野生型的葉綠體結構，野生型細胞中葉綠體含量豐富，基粒結構清晰，而al14中沒有明顯的葉綠體結構，沒有類囊體結構，僅有原片層體結構（圖2）。

圖3 部分葉綠體編碼基因在野生型和al14突變體的表達比較Fig.3.Expression analysis of some chloroplast－encoded genes in wild type and al14 mutant.

2.4 葉綠體編碼基因的定量表達分析

通過定量結果可以看出，該葉色突變對葉綠體編碼基因的表達影響是全面的，共有29個基因表達明顯上調（上調倍數＞2），上調基因主要為核糖體結構基因（chl63，chl44，chl46，chl47，chl62，chl45，chl42）和RNA聚合酶亞基基因（chl09，chl08），但是上調表達幅度最大的基因為chl34，上調了118.23倍，明顯高出其他上調基因；表達量明顯降低的基因多為光系統Ⅰ和光系統Ⅱ基因（chl28，chl01，chl06，chl33，chl16，chl35，chl05）及Rubisco大亞基基因（圖3）。

2.5 突變體的遺傳分析及定位結果

選取均勻分布于水稻12條染色體上在兩親本間有多態性的InDel標記147個。用20株白化苗進行初定位，將白化基因初步定位在第6染色體短臂上的InDel標記606949與608312之間，物理距離約為1400kb的范圍。

為了進一步縮小定位區間，選取了F2群體中2012株白化植株和5865株正常表型植株作為精細定位群體。根據公布的粳稻日本晴與秈稻9311序列，在InDel標記606949與607551之間，找到了8對在兩個親本有差異的新標記（表2），并最終將白化基因al14定位在InDel標記607511與607551之間，物理距離約40kb的范圍（圖4）。

圖4 al14在水稻第6染色體的定位Fig.4.Location of al14 on rice chromosome 6.

2.6 候選基因分析

通過作物和模式植物基因組數據庫Gramene （http：／／www.gramene.org／）預測該區域的基因組序列，得到5個ORF，其中有2個假定的表達蛋白（expressed protein），一個為假定的熱重復家族蛋白，一個PE－PGRS家族蛋白和1個假定的轉座子蛋白（表3）。根據突變體表型分析，突變基因很可能帶有葉綠體定位信號。通過PSORT（http：／／psort.hgc.jp／form.html）預測亞細胞定位結果發現，這5個候選基因中只有基因4具有葉綠體定位信號，但通過測序排除了基因4的可能，因而需要對其余幾個候選基因進行測序分析，以確定該白化基因。

3 討論

表2 用于精細定位的新InDel標記Table 2.New InDel markers for mapping.

水稻葉色白化致死突變是一種比較極端，也比較常見的葉色突變，本研究的突變體中看不到清晰的葉綠體結構，更看不到類囊體垛疊成基粒的結構；葉綠素、類胡蘿卜素含量明顯下降，這與大部分的白化突變體研究結果相似［16－17］。水稻（Oryza sativa）葉綠體基因組測序工作在1989年已經完成［18］，葉綠體編碼蛋白預測超過100個［19］。通過對64個葉綠體基因組基因表達的定量分析發現，光系統Ⅰ和光系統Ⅱ基因表達下調明顯，這可能與光系統Ⅰ和光系統Ⅱ位于類囊體膜有關。葉綠體基因組轉錄需要至少兩種RNA聚合酶。核基因組編碼的RNA聚合酶（NEP），主要轉錄葉綠體內的轉錄／翻譯相關基因，如rpoA和rpoB，而質體基因組編碼的RNA聚合酶（PEP），主要轉錄葉綠體內光合作用相關基因［20－21］。PEP由rpoA、rpoB、rpoC1和rpoC2編碼的4個亞基組成，一旦這些亞基發生突變就會引起PEP的功能受損，從而產生白化表型［22－24］。在al14突變體中，核糖體結構基因和質體編碼的RNA聚合酶亞基基因表達上調明顯，目前沒發現有這方面的報道，猜測可能是植物的應激反應。在上調基因中，基因chl34（PsbN，photosystemⅡprotein N）上調了118.23倍，上調幅度最高，該基因位于psbB操縱子的互補鏈上，psbT和psbH之間。實際上目前關于PsbN的編碼框也一直存在爭議，Kashino［25］和Gomez等［26］通過基因組學研究沒有發現PsbN蛋白，所以Kashino認為PsbN應為PsbTc［25］；Zghidi等［27］證實了擬南芥的PsbN反義RNA不僅僅局限于psbN和psbH之間的區間，甚至包含了psbT的整個編碼區。我們通過定量分析發現PsbN在野生型材料中表達量很低，這可能是為什么Kashino等和Gomez等難以用基因組學檢測到PsbN蛋白的原因。對于PsbN蛋白的功能研究，Mayes［28］發現在胞藻的psbN和psbH雙突變和psbH的單突變表型沒有明顯差別，因此認為psbN對光合自養生物的生長不是必需的，但是Torabi S等［29］發現，煙草的psbN突變體對光很敏感，光抑制后不能修復，只能在低光強下生活。Zghidi等在sig3突變體中發現psbN的轉錄水平急劇下降（幾乎檢測不到），也表明psbN的表達受到sig3的調控，SIG3（sigma3）作為一個輔助因子與PEP （plastid encoded RNA polymerase）共同起作用。al14突變體材料中，PsbN表達量急劇上升，RNA聚合酶多個亞基的表達量也顯著增加，PsbN基因表達量的上升與RNA聚合酶亞基表達量的提高是否有關？是否受到sig3的調控？這些都需要進一步的分析。

通過圖位克隆將目標基因al14定位在第6染色體40kb的范圍。目前，在水稻第6染色體上已報道了16個與葉色發育相關的基因，其中白化表型的有3個，分別為AL1，V3和GWS／ST1。在al14目標區域40kb范圍內沒有相關葉色基因報道，可能為一個新基因。

表3 定位區間基因功能注釋Table 3.Gene annotated in mapping region.

謝辭：感謝華南農業大學張群宇老師提供葉綠體基因組定量分析引物。

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Genetic Analysis and Gene Mapping of an Albino Lethal Mutant in Rice

CHUZhi－zhan1，LIUXiao－lin2，CHENYuan－ling1，LIUYao－guang1，＊
（1College of Life Sciences，South China Agricultural University／State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro－bioresources，Guangzhou 510642，China；2 Yichun University，Yichun 336000，China；＊Corresponding author，E－mail：ygliu＠scau.edu.cn）

CHU Zhizhan，LIU Xiaolin，CHEN Yuanling，et al.Genetic analysis and gene mapping of an albino lethal mutant in rice.Chin J Rice Sci，2016，30（2）：136－142.

Abstract：An albino lethal mutant，temporarily termed as al14（albino 14），was obtained from(60)Coγ－ray radiated mutant pool of japonica rice variety Nipponbare.The mutant showed albino phenotype from germination，and died after 3－leaf stage.Genetic analysis revealed that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene.The chlorophyll and carotenoid contents in al14 declined dramatically.Transmission electron microscopy examination showed there were no obvious chloroplasts except prolamellar bodies in al14.The expression level of most genes of photosystemⅠand photosystemⅡdecreased dramatically，but the ribosomal genes and RNA polymerase genes in chloroplast increased notably in al14 mutant.In al14，the expression amount of PsbN，aphotosystemⅡprotein N gene，was 118.23times as high as that in wild type.By genetic mapping with an F2population generated by crossing the heterozygous al14 plants with indica variety Huanghuazhan，the al14locus was mapped within 40kb on chromosome 6.So far there is no reported gene relative to leaf color，so it is a novel gene controlling chloroplast development.

Key words：rice；albino；gene mapping

中圖分類號：Q755；S511.01

文獻標識碼：A

文章編號：1001－7216（2016）02－0136－07

基金項目：亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室開放課題資助項目（SKL－CUSAb－2013－04）；江西省教育廳科技計劃資助項目（GJJ14707）；廣東省自然科學基金－博士啟動項目（2015A030310485）。

收稿日期：2015－09－09；修改稿收到日期：2015－12－05。