結(jié)腸腫瘤前細(xì)胞系的建立及應(yīng)用

曹海龍　許夢(mèng)雀　鄢　芳　王邦茂

300052　天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科

?

·綜述·

結(jié)腸腫瘤前細(xì)胞系的建立及應(yīng)用

曹海龍?jiān)S夢(mèng)雀鄢芳王邦茂

300052天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科

摘要：結(jié)腸腫瘤前細(xì)胞即永生化結(jié)腸上皮細(xì)胞系(IMCE)，來(lái)源于Immorto小鼠和腺瘤性結(jié)腸息肉病基因(Apc)(min/+)小鼠雜交后子代小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞，其表型正常，可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，已成為腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)研究較為理想的細(xì)胞模型。此文主要就該細(xì)胞系的建立及其在腸道腫瘤發(fā)生機(jī)制和篩選防治藥物等領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸癌；結(jié)腸腫瘤前細(xì)胞；腺瘤性結(jié)腸息肉病基因

近年來(lái)，結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)病率明顯增加。現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)與CRC發(fā)生密切相關(guān)的一些重要的基因突變，如腺瘤性結(jié)腸息肉病基因(Apc)、K-ras、p53以及錯(cuò)配修飾基因等[1]。目前仍有必要探討這些基因突變?nèi)绾斡绊懻＝Y(jié)腸上皮細(xì)胞的表型，含有基因突變的腫瘤前細(xì)胞如何發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，以及闡明已知CRC中發(fā)生變化的分子之間協(xié)同作用等。由于體外分化的人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞的培養(yǎng)非常困難，目前國(guó)內(nèi)外研究仍多以結(jié)腸癌細(xì)胞作為相關(guān)研究模型[2-3]，顯然這些腫瘤細(xì)胞并不完全符合上述研究要求。結(jié)腸腫瘤前細(xì)胞即永生化結(jié)腸上皮細(xì)胞系(IMCE)，來(lái)源于Immorto小鼠和Apcmin/+小鼠雜交后子代小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞，其表型正常，可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，已成為腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)研究較為理想的細(xì)胞模型[4]。本文主要就該細(xì)胞系的建立及其應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1結(jié)腸腫瘤前細(xì)胞系的建立

1.1Immorto小鼠及Apcmin/+小鼠

Immorto小鼠及Apcmin/+小鼠的建立為結(jié)腸腫瘤前細(xì)胞系的建立提供了可能。Immorto小鼠攜帶了一種溫度敏感的猴病毒40(SV40)大T抗原基因(tsA58)的突變形式，使之可置于干擾素-γ(IFN-γ)誘導(dǎo)的H-2Kb啟動(dòng)子(H-2Kb-tsA58)控制下。此外，研究表明80%以上散發(fā)性CRC存在Apc基因突變，家族性腺瘤性息肉病(FAP)的發(fā)生則主要與Apc基因突變有關(guān)[5]。Apcmin/+小鼠是由C57BL/6J雄性小鼠接受突變劑處理后與雌性小鼠 AKR/J 雜交，子代小鼠由于Apc基因兩條鏈中一條鏈的第850號(hào)密碼子發(fā)生無(wú)義突變，編碼亮氨酸的密碼子(TTG)轉(zhuǎn)變成終止密碼子(TAG)，形成截短APC蛋白，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白(β-catenin)不能降解，下游靶基因激活，可自發(fā)形成腸道多發(fā)腺瘤性息肉，是研究腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展的經(jīng)典動(dòng)物模型[6-8]。

1.2結(jié)腸腫瘤前細(xì)胞系的特征

隨著Immorto小鼠及Apcmin/+小鼠的建立，有學(xué)者在此基礎(chǔ)上逐步建立了IMCE細(xì)胞系[4,9]。由于IMCE細(xì)胞系來(lái)自于Immorto小鼠和Apcmin/+小鼠雜交后子代小鼠結(jié)腸上皮，因此同時(shí)攜帶一個(gè)Apc突變基因和SV40大T抗原基因；而用來(lái)源于年輕成年Immorto小鼠結(jié)腸上皮建立的細(xì)胞系被稱之為YAMC細(xì)胞系，它與IMCE細(xì)胞系最大的區(qū)別在于并不攜帶Apc突變，成為良好的實(shí)驗(yàn)對(duì)照所需的正常細(xì)胞系。SV40大T抗原基因是與p53結(jié)合并抑制其在衰老方面作用的一種永生化基因，在允許溫度條件下(33℃)，SV40大T抗原基因產(chǎn)物以一種活性形式與p53結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞永生。而在非允許溫度條件下(37℃～39℃)，基因產(chǎn)物的形式發(fā)生改變，不能結(jié)合p53使細(xì)胞永生。有學(xué)者將YAMC、IMCE及結(jié)腸癌細(xì)胞在分子遺傳學(xué)、形態(tài)學(xué)及表型等方面進(jìn)行了比較，見(jiàn)表1[9]。

表1　YAMC、IMCE細(xì)胞系及結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的區(qū)別

注：iNOS為誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶，COX-2為環(huán)氧合酶-2

2結(jié)腸腫瘤前細(xì)胞系的應(yīng)用

2.1研究結(jié)腸上皮細(xì)胞功能及其癌變機(jī)制

YAMC細(xì)胞(Apc+/+)和IMCE細(xì)胞(Apcmin/+)作為一種正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和腫瘤前細(xì)胞模型已被用于多種細(xì)胞生物學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)研究：(1)用于結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控以及黏蛋白分泌的研究[10-13]；(2)研究誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)及β-catenin等關(guān)鍵分子的調(diào)控[14]；(3)探討各種生長(zhǎng)因子對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞遷移的作用[15]；(4)用于炎癥性腸病及腸道腫瘤癌變過(guò)程中發(fā)生變化的一些重要基因如K-ras[16]、β-catenin[14]、Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子5(KLF5)[17]等作用的探討。以下是應(yīng)用的研究。

KLF與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控和癌變有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，IMCE細(xì)胞中表達(dá)的KLF5能夠增加克隆形成、細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞生長(zhǎng)，但在結(jié)腸癌細(xì)胞系中KLF5能減少克隆數(shù)量，并與細(xì)胞生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)；而將Ras基因轉(zhuǎn)染IMCE細(xì)胞后則發(fā)現(xiàn)KLF5水平下調(diào)。同樣，在Apcmin/+小鼠和FAP患者腸道腫瘤中KLF5 mRNA也顯著下降，這些結(jié)果提示KLF5的下調(diào)可能是腸道癌變過(guò)程中的早期分子事件[17]。

瘦素是一種來(lái)源于脂肪細(xì)胞的細(xì)胞因子，與肥胖和腸道炎性反應(yīng)有關(guān)。有學(xué)者用YAMC和IMCE細(xì)胞系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，瘦素可通過(guò)誘導(dǎo)天冬氨酸特異性半胱胺酸蛋白酶(caspase)的活性和凋亡途徑使YAMC細(xì)胞增殖顯著下降；而對(duì)IMCE細(xì)胞則表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，與胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)的作用類似，瘦素與IGF聯(lián)合應(yīng)用可使增殖水平更高，主要涉及的機(jī)制是激活p42/44絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p38 MAPK以及促進(jìn)核因子-κB(NF-κB)的核轉(zhuǎn)位[18]。他們進(jìn)一步開展了瘦素誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生促進(jìn)血管生成的因子從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展方面的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘦素僅在IMCE細(xì)胞中呈劑量依賴性誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)合成，用50 ng/mL瘦素處理IMCE細(xì)胞可顯著誘導(dǎo)毛細(xì)血管形成，VEGF的中和抗體能阻斷這一過(guò)程[19]。這些研究可能為肥胖相關(guān)性CRC的發(fā)生提供新的依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。

2.2闡明結(jié)腸癌變過(guò)程中相關(guān)分子間的協(xié)同作用

YAMC細(xì)胞和IMCE細(xì)胞還可用于研究結(jié)腸癌變過(guò)程中相關(guān)分子間的協(xié)同作用，以下是應(yīng)用的研究。

2.2.1Apc基因和Ras基因如前所述，由于YAMC和IMCE細(xì)胞系均是表型正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞系，可通過(guò)表達(dá)一種溫度敏感SV40大T抗原而有條件地?zé)o限增殖。在允許條件下(33℃，加IFN-γ)，YAMC和IMCE細(xì)胞系均不能在軟瓊脂上生長(zhǎng)，不能在裸鼠上成瘤。D′Abaco等[16]使用這兩種細(xì)胞系探討了一種活化的V-Ha-Ras基因?qū)δ[瘤進(jìn)展的影響，當(dāng)SV40大T抗原失活時(shí)(39℃，不加IFN-γ)，細(xì)胞增殖停止；使用攜帶V-Ha-Ras基因的病毒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，衍生出過(guò)度表達(dá)V-Ha-Ras基因的細(xì)胞系(YAMC-Ras和IMCE-Ras)，與親代細(xì)胞不同的是，在SV40大T抗原失活的條件下，YAMC-Ras和IMCE-Ras細(xì)胞仍均能繼續(xù)增殖并在軟瓊脂上形成克隆，IMCE-Ras細(xì)胞在3周之內(nèi)即可導(dǎo)致裸鼠成瘤，而YAMC-Ras細(xì)胞需要90 d方可誘發(fā)裸鼠成瘤。因此，該研究顯示Apc基因缺陷和Ras基因活化能協(xié)同促使正常結(jié)腸上皮細(xì)胞惡變。

2.2.2Apc基因和Src基因有研究應(yīng)用IMCE細(xì)胞系證實(shí)，癌基因Src活性升高聯(lián)合Apc功能的部分缺失可導(dǎo)致結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。在允許生長(zhǎng)的條件下，通過(guò)p53的失活，細(xì)胞能夠永生化；不論Apc或p53的狀態(tài)如何，Src的表達(dá)能導(dǎo)致與細(xì)胞-細(xì)胞間連接缺失相關(guān)的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變、細(xì)胞骨架破壞以及獲得侵襲性。攜帶Apc突變的IMCE細(xì)胞表現(xiàn)出Src-介導(dǎo)的錨定非依賴性增殖能力較YAMC細(xì)胞更強(qiáng)，β-catenin蛋白水平和轉(zhuǎn)錄活性更高，而選擇性Src抑制劑能阻斷細(xì)胞侵襲和錨定非依賴性增殖[20]。

有研究采用逆轉(zhuǎn)錄病毒插入誘變技術(shù)探討細(xì)胞骨架相關(guān)基因在結(jié)腸癌變過(guò)程中的作用。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染后僅在IMCE細(xì)胞誘導(dǎo)錨定非依賴性轉(zhuǎn)化克隆形成，而在YAMC細(xì)胞并不形成克隆。進(jìn)而在101個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體中確定了157個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)包括Dnah3、Ahnak、Stk17b和Rbm9等4個(gè)尋常整合位點(diǎn)。由于病毒整合，Dnah3和Ahnak上調(diào)，Dnah3發(fā)生截短，而且過(guò)表達(dá)Dnah3的IMCE細(xì)胞出現(xiàn)微管功能的受損。這些結(jié)果表明結(jié)腸癌變?cè)缙贏pc基因相關(guān)的腫瘤進(jìn)展過(guò)程中細(xì)胞骨架功能相關(guān)基因也起到重要作用[21]。

2.3篩選CRC及FAP化學(xué)防治的藥物

YAMC和IMCE細(xì)胞系模型作為正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和腫瘤前細(xì)胞還可用于篩選CRC及FAP化學(xué)防治的藥物，而且可以根據(jù)藥物對(duì)不同細(xì)胞系的作用不同，判斷藥物作用的階段是正常細(xì)胞向腫瘤前狀態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程還是腫瘤的進(jìn)展過(guò)程，為進(jìn)一步的體內(nèi)研究及臨床試驗(yàn)提供一些參考依據(jù)[9]。目前，應(yīng)用這些細(xì)胞系已篩選出黃酮類化合物、姜黃素和小檗堿等潛在的防治藥物。

2.3.1黃酮類化合物有研究應(yīng)用這兩種Apc基因不同的細(xì)胞系評(píng)價(jià)不同黃酮類化合物誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的程度，并與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)誘導(dǎo)遷移進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)柑桔素和陳皮素不能誘導(dǎo)細(xì)胞遷移，但糖基化的這些黃酮類化合物卻能對(duì)YAMC和IMCE細(xì)胞顯示出不同的遷移性，表現(xiàn)為在低濃度下即可誘導(dǎo)IMCE細(xì)胞遷移，而對(duì)YAMC細(xì)胞并無(wú)作用，應(yīng)用基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑證實(shí)這種作用依賴于MMP活性。因此，糖基化的黃酮類化合物對(duì)腫瘤前細(xì)胞遷移表型的誘導(dǎo)可能是CRC防治的一個(gè)新機(jī)制[22]。

2.3.2姜黃素Fenton等[15]分別給予YAMC和IMCE細(xì)胞系一定濃度的姜黃素、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及HGF，發(fā)現(xiàn)給予EGF和HGF 24 h后，YAMC細(xì)胞較IMCE細(xì)胞具有更大的遷移反應(yīng)，姜黃素組IMCE細(xì)胞較YAMC細(xì)胞反而具有更大的遷移反應(yīng)；還發(fā)現(xiàn)EGF和HGF誘導(dǎo)細(xì)胞遷移依賴Apc基因和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)活性，而姜黃素誘導(dǎo)遷移并不依賴Apc。

2.3.3小檗堿筆者從美國(guó)Vanderbilt大學(xué)引入該細(xì)胞系，在國(guó)內(nèi)率先開展相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)小檗堿可劑量依賴性抑制IMCE細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這種作用可能與抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和蛋白激酶B的磷酸化有關(guān)[23]。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿促進(jìn)IMCE細(xì)胞凋亡的機(jī)制為caspase非依賴途徑，可能通過(guò)刺激活性氧的產(chǎn)生進(jìn)而引起組織蛋白酶B的釋放和多腺苷二磷酸多聚酶激活，最終引起凋亡誘導(dǎo)因子活化，而對(duì)YAMC細(xì)胞并無(wú)此效應(yīng)。小檗堿還能刺激IMCE細(xì)胞泛素連接酶Cbl活化、促進(jìn)Cbl和EGFR的相互作用以及EGFR泛素化下調(diào)，從而抑制細(xì)胞增殖，敲除Cbl能阻斷小檗堿下調(diào)EGFR及抑制細(xì)胞增殖的作用[25]。由于IMCE細(xì)胞是一種表型正常的結(jié)腸腫瘤前細(xì)胞，因此小檗堿可能在早期階段即能發(fā)揮防治腫瘤的作用。

3存在的問(wèn)題及展望

結(jié)腸腫瘤前細(xì)胞系也存在一些局限性，如IMCE來(lái)源于Immorto小鼠和Apcmin/+小鼠雜交的子代小鼠的結(jié)腸上皮，但后者息肉主要出現(xiàn)在小腸，結(jié)腸息肉較少，與結(jié)腸腫瘤和FAP患者的息肉主要發(fā)生在結(jié)腸并不一致；YAMC仍不具備正常結(jié)腸上皮細(xì)胞的全部特性，如不能在細(xì)胞表面形成刷狀緣，僅能形成一些微絨毛。盡管如此，這些細(xì)胞系的建立使得培養(yǎng)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞及腫瘤前細(xì)胞成為可能，近年來(lái)在腸道腫瘤防治的研究方面發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用[4,9,26]。今后還需建立更為理想的細(xì)胞模型，為進(jìn)一步深入研究結(jié)腸腫瘤的發(fā)病機(jī)制和化學(xué)防治奠定基礎(chǔ)。

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(本文編輯：林磊)

(收稿日期：2015-03-23)

通信作者：王邦茂，tjmughgi@hotmail.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81300272，81470796)，高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20121202110018)，天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(13JCQNJC10600)

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.01.006