食管鱗癌組織miR-193b表達及其與患者臨床病理特征的關系

齊海亮，安曉穎，李曉霞，宋鑫亮，齊科雷，董稚明

(1 河北省胸科醫院，石家莊050041；2 河北醫科大學第四醫院)

食管鱗癌組織miR-193b表達及其與患者臨床病理特征的關系

齊海亮1，安曉穎1，李曉霞1，宋鑫亮1，齊科雷1，董稚明2

(1 河北省胸科醫院，石家莊050041；2 河北醫科大學第四醫院)

目的 探討miRNA-193b(miR-193b)在食管鱗癌發生、發展中的作用。方法 采用SYBR Green qRT-PCR技術檢測56例食管鱗癌患者癌組織及癌旁正常組織miR-193b表達，分析癌組織miR-193b表達與患者臨床病理特征的關系。結果 食管鱗癌組織miR-193b相對表達量為0.052±0.004，癌旁正常組織為0.089±0.005，二者比較P<0.01。食管鱗miR-193b表達與腫瘤TNM分期有關(P<0.05)，與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度和淋巴結轉移均無關(P均>0.05)。結論 食管鱗癌組織miR-193b表達下調，且與腫瘤TNM分期有關；miR-193b可能作為抑癌基因參與食管鱗癌的發生、發展。

食管鱗癌；微小RNA；微小RNA-193b

微小RNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA，能通過核酸序列的互補性結合到特定的靶mRNA上，并調節、翻譯或降解靶mRNA來調控基因表達，參與細胞的分化、增殖、凋亡等[1，2]。研究發現，miRNA還可作為癌基因或抑癌基因，調控腫瘤的發生、發展和轉移[3]。miRNA-193b(miR-193b)是miRNA家族成員之一，其表達變化與胃癌、結腸癌、子宮內膜癌等密切相關，但目前鮮見其與食管鱗癌關系的報道。2014年9月～2015年6月，我們觀察了食管鱗癌組織中miR-193b的表達，現分析結果，探討其在食管鱗癌發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取同期河北省胸科醫院手術切除的食管鱗癌組織及癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)各56例份，均經組織病理學檢查明確診斷。患者男36例、女20例，年齡39～77歲、中位年齡60歲；組織分化程度：高、中分化23例，低分化33例；無淋巴結轉移32例，有淋巴結轉移24例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ、Ⅳ期16例。所有患者術前未行放療、化療及生物治療等。

1.2 食管鱗癌組織及癌旁正常組織miR-193b表達檢測 取食管鱗癌組織及癌旁正常組織標本，TRIzol法提取組織總RNA。紫外分光光度計測定RNA的濃度、純度和完整性，經檢測所提取的總RNA無降解，標本合格，可用于后續實驗。按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應。反應體系20 μL，其中總RNA 1.5 μL、特異性莖環反轉錄引物2 μL、RNA酶抑制劑1 μL、緩沖液4 μL、逆轉錄酶1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、DECP水8.5 μL。反應條件：42 ℃ 60 min，25 ℃ 5 min，70 ℃ 5 min。逆轉錄反應后合成cDNA，-20 ℃保存備用。使用Primer Premier5.0軟件設計miR-193b和內參基因U6的引物序列，由中國北京賽百盛基因技術有限公司合成。按照TaqMan PCR試劑盒說明進行PCR反應。PCR反應體系20 μL，其中cDNA模板2 μL、上下游引物各0.6 μL、2×taqman universal pcr master mix 10.0 μL、DECP水6.8 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；72 ℃延伸7 min。每個樣本做3個復孔。記錄每個熒光反應管中的熒光信號達到所設定的閾值時所經歷的循環數即Ct值，將原始數據取3次重復的平均值，以U6為內參，ΔCt=CtmiR-193b-CtU6。以2-ΔΔCt法計算miR-193b的相對表達量。分析食管鱗癌組織miR-193b表達與患者臨床病理特征的關系。

2 結果

2.1 癌組織、癌旁正常組織miR-193b表達比較 癌組織miR-193b相對表達量為0.052±0.004，癌旁正常組織為0.089±0.005，兩者比較P<0.01。

2.2 食管鱗癌組織miR-193b表達與患者臨床病理特征的關系 見表1。

表1 食管鱗癌組織miR-193b表達與患者 臨床病理特征的關系±s)

3 討論

miRNA是一類非編碼小分子RNA，其主要功能是參與并調控基因的表達，通過識別靶基因mRNA的3′-非翻譯區，抑制靶基因表達[4]。自從首個miRNA功能被確認以來，miRNA已成為生命科學研究領域的熱點之一。miRNA幾乎參與了所有的生物學過程，維系著生物正常基因表達和生理功能;其表達異常可導致疾病的發生。近年研究發現，很多miRNA通過調控腫瘤細胞的增殖、分化、遷移等生物過程，參與腫瘤的發生、發展過程[5，6]。

miR-193b的編碼基因位于人16號染色體上，是非編碼的小分子RNA。作為一種重要的調節因子，miR-193b參與了機體諸多生理病理過程[7]。研究發現，miR-193b參與了軟骨的新陳代謝，隨著年齡增長其表達上調[8]；但Ⅱ型肌萎縮患者miR-193b-3p表達下調[9]；miR-193b在非小細胞肺癌組織中表達下調，當其過表達時可顯著降低肺癌A549細胞的增殖、侵襲與轉移能力[10]。Rauhala等[11]研究發現，miR-193b是前列腺癌的腫瘤抑制因子。Li等[12]報道，在乳腺癌細胞內下調miR-193b表達，可明顯增加尿纖維蛋白溶酶原激活物，進而刺激瘤細胞的惡性表型發生。Lenarduzzi等[13]研究發現，在敲除頭頸部鱗狀細胞癌FaDu細胞系的miR-193b基因，可使癌細胞增殖、侵襲、轉移能力提高，并且在體內可抑制瘤細胞的形成。miR-193b在胃癌、胰腺癌、子宮內膜癌等組織中表達下調，導致uPA、STMN1、MMP-2、MMP-9等靶基因表達上調；而這些靶基因都是引起腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的主要分子。因此認為，miR-193b在多種惡性腫瘤中起到負調控作用，可作為一種腫瘤抑制因子。但目前其在食管鱗癌組織中的表達鮮見報道。

本研究結果顯示，食管鱗癌組織miR-193b的相對表達量明顯低于癌旁正常組織；miR-193b表達與腫瘤TNM分期有關，而與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結轉移無關。因此認為，miR-193b在食管鱗癌組織中表達下調可能引起某種促癌機制活化，導致食管鱗癌發生、發展，但是其具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

[1] Cohn DE, Fabbri M, Valeri N, et al. Comprehensive miRNA profiling of surgically staged endometrial cancer[J]. Am J Obstet Gynecol, 2010,202(6):656.

[2] Zimmerman AL, Wu S. MicroRNAs, cancer and cancer stem cells[J]. Cancer Lett, 2011,300(1) :9-10.

[3] Zhang F, Yang Z, Cao M, et al. miR-203 suppresses tumor growth and invasion and down-regulates miR-21 expression through repressing Ran in esophageal cancer[J]. Cancer Lett, 2014,342(1):121-129.

[4] Huntzinqer E, Izaurralde E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay[J]. Nat Rev Genet, 2011,12(2):99-110.

[5] Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers[J]. Nat Rev Cancer, 2006,6(11):857-866.

[6] Li H, Zheng D, Zhang B, et al. miR-208 promotes cell proliferation by repressing SOX6 expression in human esophageal squamous cell carcinoma[J]. J Transl Med, 2014(12):196.

[7] Gao XN, Lin J, Gao L, et al. MicroRNA-193b regulates c-Kit proto-oncogene and represses cell proliferation in acute myeloid leukemia[J]. Leuk Res, 2011,35(9):1226-1232.

[8] Ukai T, Sato M, Akutsu H, et al. MicroRNA-199a-3p, microR NA-193b, and microRNA-320c are correlated to aging and regulatehuman cartilage metabolism[J]. J Orthop Res, 2012,30(12):1915-1922.

[9] Greco S, Perfetti A, Fasanaro P, et al. Deregulated microRNAs inmyotonic dystrophy type 2[J]. PLoS One, 2012,7(6):e39732.

[10] Hu H, Li S, Liu J, et al. MicroRNA-193b modulates proliferation, migration and invasion of non-small cell lung cancer cells[J]. Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai), 2012,44(5):424-430.

[11] Rauhala HE, Jalava SE, Isotalo J, et al. miR-193b is an epigenetically regulated putative tumor suppressor in prostate cancer[J]. Int J Cancer, 2010,127(6):1363-1372.

[12] Li XF, Yan PJ, Shao ZM. Downregulation of miR-193b contributes to enhance urokinase-type plasminogen activator (uPA) expression and tumor progression and invasion in human breast cancer[J]. Oncogene, 2009,28(44):3937-3948.

[13] Lenarduzzi M, Hui AB, Alajez NM, et al. MicroRNA-193b enhances tumor progression via down regulation of neurofibromin 1[J]. PLoS One, 2013,8(1):e53765.

河北省科技支撐計劃項目(132777221)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.026

R735.1

B

1002-266X(2016)32-0074-02

2015-12-21)