內蒙紫草總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

林海楨，施勝英，李舒婕，周溦，林敬明（南方醫科大學珠江醫院藥劑科，廣東廣州510282）

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內蒙紫草總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

林海楨，施勝英，李舒婕，周溦，林敬明*
（南方醫科大學珠江醫院藥劑科，廣東廣州510282）

摘要：以內蒙紫草總黃酮得率為指標，在單因素試驗基礎上，采用響應面法優化超聲波輔助提取工藝，并以蘆丁為對照，測定內蒙紫草總黃酮的抗氧化活性。結果表明，響應面試驗獲得的內蒙紫草總黃酮的最佳提取工藝為乙醇體積分數58.57%，料液比1∶43.33（g/mL），超聲時間3.33h，此時總黃酮得率4.94%。

關鍵詞：內蒙紫草；總黃酮；超聲波輔助提取；響應面法；抗氧化活性

內蒙紫草，又名黃花軟紫草、黃紫草、假紫草[1]，紫草科軟紫草屬植物，分布于甘肅，內蒙古等地[2]，藥用干燥根，主要成分有蒽醌、多糖、黃酮等化合物，具有較好的抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗過敏、保肝降酶等作用[3]，開發應用前景廣闊。超聲波能在液體中產生“空穴作用”，破壞植物細胞結構，使提取液不斷振蕩，有助于黃酮類化合物的溶出和擴散，同時產生的熱效應保持一定水溫，大大提高了植物中有效成分的得率[4]。響應面法是采用多元二次回歸方法作為函數估計的工具，將多因子試驗中因素與指標的相互關系用多項式近似擬合，依此可對函數的響應面進行分析，研究因子與響應面之間、因子與因子之間的相互關系[5]。因此，本試驗采用超聲波輔助提取內蒙紫草中的總黃酮，在單因素試驗基礎上，通過響應面法獲得最佳提取工藝條件，并以蘆丁為對照，測定內蒙紫草總黃酮對1，1-二苯-2-苦基肼（DPPH）和2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+）的清除能力來判定其抗氧化活性，為其藥理學研究和野生資源的開發利用提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

內蒙紫草：購自南方醫科大學珠江醫院中藥房，經筆者鑒定為真品；蘆丁標準品：麥克林公司，批號C10018061，純度＞99 %；DPPH：阿拉丁，批號40248；ABTS：阿拉丁，批號36567；石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、過硫酸鉀：均為分析純。

1.2儀器設備

DW-500C密封搖擺式高速粉碎機：浙江省臺州市大畏機械廠；KQ-600DE超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；BL-2000S電子天平：美國Setra公司；R-200D精密電子天平：Sartorius公司；Lambda-35紫外可見分光光度計：美國Perkin Elmer公司；Centrifuge 5810R離心機：Eppendorf AG公司；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3方法

1.3.1標準曲線的繪制[6]

精確稱取蘆丁標準品31.50 mg，加60 %乙醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，量取25 mL于50 mL容量瓶，用水稀釋至刻度，制成0.157 5 mg/mL蘆丁對照品儲備液，精密量取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL于10 mL具塞試管中，分別加30 %乙醇至5 mL，加5 %NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6min，加Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6min，加4 % NaOH溶液4 mL，用水稀釋至10 mL，于510 nm波長處測定吸光度（A），以濃度C對A進行線性回歸，得回歸方程A = 9.899 8C + 0.005 7（R2=0.999 5），線性范圍0～0.078 mg/mL。

1.3.2總黃酮提取及含量測定

將紫草粉碎，過2號篩，加一定倍量石油醚超聲脫脂2次，濾渣烘干，備用。準確稱取脫脂后紫草粉末1 g 于100 mL錐形瓶中，以一定料液比加入一定體積分數乙醇溶液，封口塞密封，浸泡過夜。在室溫下，超聲波輔助提取規定時間，離心，沉淀以同樣條件提取和離心，合并兩次上清液，并用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中[7]，取該溶液1 mL，按標準曲線項下測定樣品吸光度，計算總黃酮得率。

式中：C為黃酮濃度，mg/mL；V1為測定時具塞試管中溶液體積，mL；V2為待測樣液分取的體積，mL；V3待測樣液的總體積，mL；W為脫脂后的樣品重，g。

1.3.3總黃酮響應面試驗

根據單因素試驗結果，每個因素取3個水平進行優化。以總黃酮得率為指標，采用響應面試驗確定最佳提取條件，因素水平如表1。

1.3.4總黃酮抗氧化活性測定

1.3.4.1DPPH自由基清除能力測定[8-10]

移取不同質量濃度（6.25、12.5、25、50、100、200、 400、450 μg/mL）紫草總黃酮溶液各2.5 mL，各加入250 μg/mL DPPH溶液2.5 mL于具塞試管中，振蕩搖勻，黑暗處放置30min，于517 nm處測定A1；空白組以95 %乙醇代替樣品溶液，測定A0；對照組以95 %乙醇代替DPPH溶液，測定A2。以95 %乙醇調零，平行3次，用同樣濃度系列的蘆丁溶液作陽性對照。

表1　紫草總黃酮超聲提取工藝響應面因素水平Table 1 Factors and levels used in RSM for total flavonoids from Arnebia guttata Bunge

1.3.4.2ABTS+自由基清除能力測定

參照文獻方法[11-12]并做改進，移取不同質量濃度（6.25、12.5、25、50、100、200、400、450 μg/mL）紫草總黃酮溶液各0.3 mL，各加入ABTS+工作液3 mL于具塞試管中，振蕩搖勻，室溫暗處條件下反應6min，于734 nm處測定A1；空白組以95 %乙醇代替樣品溶液，測定A0；對照組以95 %乙醇代替ABTS+工作液，測定A2。以95 %乙醇調零，平行3次，用同樣濃度系列的蘆丁溶液作陽性對照。

2　結果與討論

2.1單因素試驗

2.1.1提取次數對總黃酮得率的影響

固定料液比1∶30（g/mL），乙醇體積分數70 %，超聲功率600 W，超聲時間0.5 h，考察提取次數對總黃酮得率的影響，結果見圖1。

圖1　提取次數對總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of repeated extraction number on extraction yield of total flavonoids

由圖1可知，提取次數從1次增加到2次，提取率升高幅度較明顯，繼續增加提取次數，提取率無明顯提高，這是因為此時內蒙紫草中殘留的黃酮類物質已經很少，故從減少操作環節，節約成本考慮，提取次數宜選擇2次。

2.1.2乙醇體積分數對總黃酮得率的影響

固定料液比1∶30（g/mL），超聲功率600 W，超聲時間0.5 h，提取2次，考察乙醇體積分數對總黃酮得率的影響，結果見圖2。

圖2　乙醇體積分數對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

由圖2可知，隨著乙醇體積分數升高，得率有一個先升后降的趨勢，在乙醇體積分數60 %時得率達最高。這是因為總黃酮為極性化合物，根據相似相溶原理，通過調節乙醇和水的配比改變乙醇溶液的極性，對總黃酮的提取效率有較大影響[13]，故選擇乙醇體積分數為60 %。

2.1.3料液比對總黃酮得率的影響

固定乙醇體積分數60 %，超聲功率600 W，超聲時間0.5 h，提取2次，考察料液比對總黃酮得率的影響，結果見圖3。

圖3　料液比對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由圖3可知，隨著料液比增大，得率亦逐漸增大，當料液比比達到1∶40（g/mL）時，再增大料液比，得率變化不大，這是因為料液比1∶40（g/mL）時，黃酮類化合物的溶解基本達到完全。通過對得率、溶劑用量、能量耗損和后續工藝簡化的綜合考慮，選擇料液比1:40 （g/mL）進行優化試驗。

2.1.4超聲功率對總黃酮得率的影響

固定料液比1∶40（g/mL），乙醇體積分數60 %，超聲時間0.5 h，提取2次，考察超聲功率對總黃酮得率的影響，結果見圖4。

圖4　超聲功率對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of total flavonoids

由圖4可知，隨著超聲功率增加，得率不斷上升，并在600 W時達到極大值，可能是由于超聲波的振動，擊碎了紫草內部細胞壁，加速了細胞內部黃酮類物質的浸出速率[14]，因此提取得率逐漸增大，故選擇超聲功率為600 W。

2.1.5超聲時間對總黃酮得率的影響

固定料液比1∶40（g/mL），乙醇體積分數60 %，超聲功率600 W，提取2次，考察超聲時間對總黃酮得率的影響，結果見圖5。

圖5　超聲時間對總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of extraction time on extraction yield of total flavonoids

由圖5可知，在提取3 h前，總黃酮不能充分地轉移到溶液中，隨著提取時間增加，總黃酮含量也增加，在3 h時達到峰值，之后，繼續增加時間，得率有所下降，這可能是因為隨著提取時間的增加，溫度急劇升高，導致總黃酮分解或揮發所致[13]，故選擇提取時間為3 h。

2.2響應面試驗

響應面試驗組合與結果見表2；回歸模型的方差分析結果見表3；各因素之間對得率影響的響應面和等高線見圖6、圖7、圖8。

表2　紫草總黃酮超聲提取工藝響應面安排Table 2 Response surface design arrangement and experimental results for total flavonoids from Arnebia guttata Bunge

表3　超聲提取工藝回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the fitted regression model

應用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中數據進行二次多元回歸擬合，得到A、B、C與紫草總黃酮得率的二次多項回歸方程:

Y=4.85-0.073A+0.18B+0.18C+0.022AB-0.032AC+ 0.029BC-0.3A2-0.3B2-0.15C2。

圖6　乙醇體積分數和料液比對紫草總黃酮得率的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration and solid-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids from Arnebia guttata Bunge

圖7　乙醇體積分數和超聲時間對紫草總黃酮得率的影響Fig.7 Effects of ethanol concentration and extraction time on extraction yield of total flavonoids from Arnebia guttata Bunge

對上述回歸模型進行顯著性檢驗，結果見表3，因變量和全體自變量的線性關系顯著（r=0.953 6），模型的顯著水平遠遠＜0.05，此時二次多項回歸方差模型高度顯著，說明該試驗方法可靠，可用此模型對超聲提取內蒙紫草總黃酮的工藝結果進行分析和預測。

圖8　料液比和超聲時間對紫草總黃酮得率的影響Fig.8 Effects of solid-liquid ratio and extraction time on extraction yield of total flavonoids from Arnebia guttata Bunge

根據回歸方程，作響應曲面圖，考察所擬合的響應曲面形狀，分析乙醇體積分數、料液比和超聲時間對得率的影響。其響應曲面及其等高線如圖6～圖8所示，3組圖直觀地反映了各因素對響應值的影響，以料液比、超聲時間影響較為顯著，乙醇體積分數次之。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[13]。比較3組圖并結合表3中P可知:模型的一次項A（P＞0.05）不顯著、B（P＜0.01）高度顯著，C（P＜0.05）顯著；交互項都不顯著；二次項A（P＜0.01）和B（P＜0.01）均高度顯著，表明各因素對得率的影響不是簡單的線性關系，其中，料液比、超聲時間對總黃酮得率的影響最顯著，表現為曲線較陡；而乙醇體積分數次之，表現為曲線較平滑，且隨其數值的增加或減少，響應值變化較小。

綜上所述，根據回歸模型通過Design-Expert軟件分析得出，紫草總黃酮最佳提取條件為乙醇體積分數58.57 %，料液比1∶43.33（g/mL），超聲時間3.33 h。為實際操作方便，選取乙醇體積分數59 %，料液比1∶43 （g/mL），超聲時間3.3 h。

為檢驗響應面試驗設計所得結果的可靠性，采用上述優化出的工藝參數進行3次驗證試驗，結果總黃酮平均得率4.91 %（RSD=1.46 %），與預測值4.94 %相差不大，說明該方程與實際情況擬合較好，所建模型正確，具有實用價值。

2.3抗氧化活性測定

2.3.1DPPH自由基清除能力測定

不同濃度的內蒙紫草總黃酮和蘆丁對DPPH自由基的清除作用如圖9所示。

圖9　紫草總黃酮和蘆丁清除DPPH自由基的能力Fig.9 DPPH radical scavenging activities of total flavonoids and rutin

由圖9可知，紫草總黃酮和蘆丁對DPPH自由基具有一定的清除能力，且隨質量濃度的增加而增強，呈現明顯的量效關系，經過計算IC50（半數抑制濃度）值，兩者分別為66.76、33.19 μg/mL，表明紫草總黃酮清除DPPH自由基的能力弱于蘆丁，這可能是因為紫草總黃酮為混合物，純度低，雜質較多，抑制了其活性[15]。

2.3.2 ABTS+自由基清除能力測定

不同濃度的內蒙紫草總黃酮和蘆丁對ABTS+自由基的清除作用如圖10所示。

圖10　紫草總黃酮和蘆丁清除ABTS+自由基的能力Fig.10 ABTS+radical scavenging activities of total flavonoids and rutin

由圖10可知，隨著紫草總黃酮和蘆丁質量濃度的增加，對ABTS+的清除率亦隨之增大，呈現出較明顯的量效關系，經過計算IC50（半數抑制濃度）值，兩者分別為22.19、30.60 μg/mL，可見紫草總黃酮清除ABTS+自由基的能力稍強于蘆丁。

3　結論

通過單因素試驗確定各因素的最佳水平，在此基礎上采用響應面分析法對內蒙紫草中總黃酮的超聲波輔助提取工藝進行優化，得到最佳工藝修正條件為乙醇體積分數59%、料液比1∶43（g/mL），超聲時間3.3h。在此條件下，經3次試驗驗證，總黃酮平均得率4.91%，與模型預測值4.94 %非常接近。說明該工藝科學合理，安全有效，在黃酮類化合物提取過程中具有很好的應用前景。

抗氧化試驗表明，紫草總黃酮具有較強的清除DPPH 和ABTS+的能力，其IC50相應為66.76、22.19 μg/mL，分別是蘆丁的約2.01倍和0.73倍，可見紫草總黃酮清除DPPH自由基能力小于蘆丁，而清除ABTS+自由基的能力卻優于蘆丁，且始終大于同質量濃度下的蘆丁；同質量濃度的總黃酮對ABTS+自由基清除作用大于DPPH自由基，原因可能與提取物中黃酮結構有關及對不同體系的抗氧化作用不同所致[16]。內蒙紫草體外抗氧化活性成分，除與黃酮有關外，還可能與醇提物中復雜的其它成分有關[17]，至于抗氧化成分的種類、化學結構及其機理還有待于進一步的研究。

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Study on Extraction Process and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Arnebia guttata Bunge

LIN Hai-zhen，SHI Sheng-ying，LI Shu-jie，ZHOU Wei，LIN Jing-ming*
（Department of Pharmacy，Zhujiang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510282，Guangdong，China）

Abstract：The objects of this study were to optimize extraction process and to research in vitro antioxidant activity of total flavonoids from Arnebia guttata Bunge.The extraction technology was optimized by single factor experiment and response surface methodology and the antioxidant effect was determined with rutin as positive control.The results had indicated that the extraction optimum technological conditions were the solid -liquid ratio 1∶43.33（g/mL），the concentration of ethanol 58.57 %，the extracting time 3.33 h，and the yield of total flavonoids was 4.94 %.

Key words：Arnebia guttata Bunge；total flavonoids；ultrasonic -assisted extraction；response surface methodology；antioxidant activity

DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.010

基金項目:廣東省自然科學基金項目（S2013010014796）；海珠區科普計劃項目（2014HZKP-DS-2）

作者簡介:林海楨（1988—），男（漢），在讀碩士，研究方向：天然產物的研究開發與臨床藥學研究。

*通信作者:林敬明（1963—），男（漢），教授，博士。

收稿日期:2015-12-17