酶解法提取蒲公英多糖工藝

徐瀾，王明華，渠娟娟，安偉（.忻州師范學院生物系，山西忻州034000；.山西省農業科學院玉米研究所，山西忻州034000）

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酶解法提取蒲公英多糖工藝

徐瀾1，王明華1，渠娟娟1，安偉2
（1.忻州師范學院生物系，山西忻州034000；2.山西省農業科學院玉米研究所，山西忻州034000）

摘要：通過單因素試驗和Box-Behnken中心組合試驗設計，優化酶解法提取蒲公英多糖工藝。研究了酶解pH、酶解時間、酶解溫度、酶濃度等因素對蒲公英多糖提取率的影響，利用響應面法處理試驗數據，確定了酶解法優化蒲公英多糖的提取工藝參數。對蒲公英多糖提取率的影響次序為:酶濃度＞酶解時間＞酶解溫度＞pH；木瓜蛋白酶提取蒲公英多糖提取率（3.11%）最高；最優提取工藝參數為:pH為9.20，酶解溫度為46.18℃，酶解時間為123min，酶含量為3.38%（酶質量/蒲公英質量）。

關鍵詞：蒲公英；多糖；酶解法；響應面法

蒲公英（Herba Taraxaci）為菊科多年生草本植物，我國約有11種[1]，分布于東北、華北及陜西、甘肅、青海等地，味苦，性寒，具有清熱解毒、消腫散結和利尿通淋的功效。植物多糖具有多種生物活性，抗病毒、降血糖及抗腫瘤和免疫促進的臨床應用[2]，如蒲公英多糖具有抗突變、抗氧化、抗疲勞和提高免疫等生物活性[3]等功效。多糖提取方法主要有水浸提取法、酸堿提取法、微波輔助提取法、酶提取法等，傳統高溫水提取工藝時間較長，而且能耗大、效率低；酸堿提取易破壞多糖的結構和活性；微波法省時，但是效率較低；超聲波法雖然效率較高，但噪音大，儀器昂貴[4]。酶解法具較溫和地分解植物組織的特點，能最大限度地提取有效成分，可大幅提高提取率，且不易破壞多糖的結構和活性[5]，近年來已逐漸成為植物活性成分提取工藝研究的熱點[6-8]。采用酶解法提取蒲公英多糖，旨在探索一種高效的蒲公英多糖提取工藝。

本研究利用酶解法從蒲公英中提取多糖，該法目前尚少見報道。同時，在單因素試驗的基礎上，以蒲公英多糖提取率為響應因子，對提取過程中的各主要因素采用響應面法（response surface methodology，RSM）進行優化，為科學、合理地利用蒲公英資源提供參考。

1　材料與儀器

蒲公英：山西忻州。

722s可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；pHS-3C型pH（酸度）計：上海天達儀器有限公司；800B離心機：上海安亭科學儀器制造廠；AB204-N電子分析天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

葡萄糖標準品（分析純）、苯酚（分析純）、濃硫酸（分析純）均為天津市分船化學試劑科技有限公司；纖維素酶（BR生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；果膠酶（生物試劑）：天津市光復精細化工研究所；木瓜蛋白酶：北京化學試劑公司。

2　方法

采用硫酸苯酚法[9-10]。

2.1多糖的提取

取蒲公英粉末0.5 g，選擇50 mL蒸餾水，加入適量的木瓜蛋白酶，在適量溫度下進行不同時間的水浴加熱，離心后得多糖提取液。

2.2多糖含量的測定

繪制標準曲線。標準溶液的配制:準確稱取干燥恒重葡萄糖100 mg，用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，濃度為1 mg/mL葡萄糖貯備溶液，再準確移取10 mL，用蒸餾水定容至100 mL，得0.1 mg/mL葡萄糖使用液。準確吸取0.1 mg/mL的葡萄糖使用液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL，分別置于試管中，各加入6.25 %苯酚溶液1mL，搖勻，置于30℃的水浴中，滴加濃硫酸5.0mL，搖勻后，煮15min，取出后用蒸餾水定容到25 mL，于室溫下顯色20min，于波長490 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，求得回歸方程A=0.039C+0.013 3，相關系數R2=0.999 2。

準確吸取以上所得蒲公英多糖提取液1 mL，按標準曲線制備方法測定吸光度，并以吸光度求出蒲公英中多糖的含量[9]。多糖含量公式：

2.3單因素試驗

多糖提取率的影響因素很多，本試驗選擇酶解時間、酶解溫度、酶濃度和酶解pH為因素，考察各因素對蒲公英多糖提取工藝的影響，采用單因素試驗確定最佳工藝條件。由文獻知，木瓜蛋白酶具有一定的優勢。因此，在后面的試驗中選擇用木瓜蛋白酶來進行多糖的提取試驗。

2.4響應面法優化試驗

在單因素試驗的基礎上，以酶解溫度、酶解時間、酶濃度和酶解pH作為考察對象，以蒲公英多糖提取率為響應值，采用Design Expert 7.0.0統計分析軟件的響應面法安排試驗，得到最優化提取工藝參數。

3　結果與分析

3.1木瓜蛋白酶提取蒲公英多糖的單因素試驗

3.1.1酶解時間對蒲公英多糖提取率的影響

在酶濃度為3 %，溫度為50℃，pH=5的條件下，確定最佳酶解時間，以酶解時間為橫坐標，蒲公英多糖提取率為縱坐標作圖，結果如圖1所示。

圖1　酶解時間對蒲公英多糖提取率的影響Fig.1 Effect of enzymolysis time on the extraction yield of polysaccharides from Herba Taraxaci

由圖1可知，隨著酶解時間的增加，多糖提取率逐漸升高，當達到120min時，多糖提取率達到最大，再延長酶解時間，多糖提取率有所下降。因此，最佳酶解時間是120min。

3.1.2酶解溫度對蒲公英多糖提取率的影響

圖2　酶解溫度對蒲公英多糖提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis solution temperature on the extraction yield of polysaccharides from Herba Taraxaci

在酶濃度為3 %，pH=5，酶解時間為120min的條件下，確定最佳酶解溫度，并以酶解溫度為橫坐標，蒲公英多糖的提取率為縱坐標，見圖2。隨酶解溫度升高，蒲公英多糖提取率增加，當溫度達50℃時，多糖提取率達最大值，之后隨酶解溫度的繼續升高，提取率反而下降。這可能是因為溫度不僅影響多糖的溶出速度，而且影響蛋白酶的活性，隨著溫度升高，木瓜蛋白酶的酶解活性增加，進而蒲公英多糖的提取率升高；但當溫度超過50℃之后，提取率反而下降，主要是由于此時木瓜蛋白酶的活性反而降低甚至喪失，因為每一種酶的活性都有一個最佳的溫度范圍，超過這個范圍就會引起酶活性降低，并且每一種酶都有一個最適溫度，在最適溫度時活性最大，即蒲公英多糖的提取率最大。因此，酶解最佳溫度為50℃。

3.1.3酶濃度對蒲公英多糖提取率的影響

以酶濃度為橫軸，蒲公英多糖提取率為縱軸，在酶解溫度是50℃，pH = 5，酶解時間為120min條件下確定最佳酶濃度，見圖3。隨酶濃度的增加，蒲公英多糖提取率增加。當酶濃度超過3 %后，蒲公英多糖隨酶濃度增加變緩。考慮到成本，酶解時的最佳酶濃度為3 %。

圖3　酶濃度對蒲公英多糖提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on the extraction yield ofpolysaccharides from Herba Taraxaci

3.1.4酶解pH對蒲公英多糖提取率的影響

在酶濃度為3%，溫度為50℃，酶解時間為120min的條件下，確定最佳酶解pH。以pH為橫坐標，蒲公英多糖的提取率為縱坐標作圖，見圖4。

圖4　酶解pH對蒲公英多糖提取率的影響Fig.4 Effect of the pH on the extraction yield of polysaccharides from Herba Taraxaci

隨著pH的增加，蒲公英多糖的提取率逐漸增加；當pH= 9時，蒲公英多糖的提取率達到最大值，然后隨著pH值的繼續增加蒲公英多糖的提取率反而下降。這可能是因為酶對pH非常敏感，每一種酶都是在一定pH范圍內發揮作用的。如果環境的pH超出這個范圍，酶的活性就會降低甚至失去活性，只有在一定的pH時，其活性才會達到最高，該值即是酶的最適pH，偏離該值，無論pH是增加或減少，酶的活性都會下降，進而引起蒲公英多糖提取率下降。由圖4知，在pH= 9時蒲公英多糖的提取率最大，所以酶解最佳pH 為9。

3.2響應面分析法優化工藝條件

3.2.1響應面分析因素水平的選取

由單因素試驗結果，選取酶解溫度（a）、酶解時間（b）、酶濃度（c）和酶的pH（d）4個因素進行中心組合設計（central composite design，CCD）（取中心點為6），利用Design Expert 7.0.0軟件進行數據擬合，以+ 1、0、- 1分別代表自變量高、中、低水平，因子編碼及水平見表1。

表1　響應面分析因素水平試驗設計Table 1 Experiment design of four factors and three levels of RSM

3.2.2響應面分析方案及結果

以多糖提取率為響應值（Y），以A =（a-50）/10，B = （b- 120）/ 30，C =（c - 3）/ 1，D =（d-9）/1為自變量，采用四因素三水平試驗進行響應面分析，中心組合設計的試驗結果及其預測值見表2。

表2　響應面分析方案及試驗結果Table 2 Box-Behnkenl central composite design arrangement and experimentral results

對試驗數據進行多項擬合回歸，建立回歸方程Y =+3.07 -0.11A +0.038B +0.094C +0.032D +0.015AB -0.095AC-0.035AD-0.065BC+0.10BD+0.052CD-0.20A2-0.16B2-0.18C2-0.18D2，對模型進行方差分析，結果見表3。

表3　蒲公英多糖提取率的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation on the extraction yield of Herba Taraxaci polysaccarides

從回歸方程模型因變量的方差分析知（表3），P= 0.006 0＜0.05，表明所選用的二次多項式模型具有高度的顯著性（P＜0.01）[10]，即回歸方程描述各因子與響應值之間的關系時，其應變量與全體自變量之間的線性關系是顯著的，即這種試驗方法是可靠的；變異系數（5.25 %）較低，表明本試驗穩定性較好；模型的相關系數R2=0.850，說明該模型可靠性較好。失擬項用來表示所用模型與試驗擬合的程度，P=0.200 2＞0.05，表明失擬不顯著。模型一次項A從回歸方程模型因變量的方差分析知，模型一次項C（P=0.000 2）差異極顯著，B （P=0.048 5）差異顯著，A（P=0.144 2），D（P=0.473 7）差異不顯著；交互項AB（P=0.197），AC（P=0.225 2），差異顯著CD（P=0.234 5），BD（P=0.590 7），AD（P=0.663 2），BC（P=0.917 5）差異不顯著；二次項A2（P=0.010 6），D2（P=0.010 8）差異顯著，C2（P=0.056 5），B2（P=0.458 4）差異不顯著。表明酶濃度對多糖提取率的主效應明顯，且在酶解時間、酶解溫度、酶濃度和pH之間存在交互作用。依據系數值A=2.39，B=4.67，C=25，D=0.54可知因素的主效應關系為:酶濃度＞酶解時間＞酶解溫度＞pH值。

3.2.3響應面圖分析

響應面可直接反映出各因子對響應值的影響大小，回歸方程繪制的響應曲面分析，見圖5～圖10。

圖5　酶解時間和溫度對多糖提取率的響應面圖Fig.5 Response surface plot of time and temperaturevs extraction yield of polysaccharides

在試驗范圍內，酶解時間不變，隨著酶解溫度的增加，多糖提取率增加到最大值然后有所下降；酶解溫度不變，酶解時間增加，多糖提取率逐漸增大然后下降；這與單因素試驗分析結果相吻合。多糖提取率的變化速率顯示酶解時間主效應大于酶解溫度。

圖6　酶濃度和溫度對多糖提取率的響應面圖Fig.6 Response surface plot of enzyme concentration and temperaturevs extraction yield of polysaccharides

在試驗范圍內，酶解溫度不變，隨著酶濃度的增加，蒲公英多糖提取率增加到最大值后有所下降；酶濃度一定，隨酶解時間增加，多糖提取率逐漸增大之后下降。這與單因素試驗分析結果亦吻合。可見，多糖提取率的變化速率顯示酶濃度主效應大于酶解溫度，與統計結果相符。

在試驗范圍內，酶解溫度不變，隨著pH的增加，多糖提取率增加到最大值然后有所下降；pH不變，酶解溫度增加，多糖提取率逐漸增大然后下降。這與單因素試驗結果相一致。多糖提取率的變化速率顯示酶解溫度主效應大于pH，與統計結果一致。

圖7　pH和溫度對多糖提取率的響應面圖Fig.7 Response surface plot of pH and temperaturevs extraction yield of polysaccharides

圖8　酶濃度和時間對多糖提取率的響應面圖Fig.8 Response surface plot of enzyme concentration and time vs extraction yield of polysaccharides

在試驗范圍內，酶解時間不變，隨著酶濃度的增加，多糖提取率增加到最大值然后有所下降；酶濃度不變，酶解時間增加，多糖提取率逐漸增大然后下降；與單因素實驗結果相吻合。多糖提取率的變化速率顯示酶濃度主效應大于酶解時間，與統計分析相符。

圖9　pH和時間對多糖提取率的響應面圖Fig.9 Response surface plot of pH and time vs extraction yield of polysaccharides

圖10　pH和酶濃度對多糖提取率的響應面圖Fig.10　Response surface plot of pH and enzyme concentration vs extraction yield of polysaccharides

在試驗范圍內，酶解時間不變，隨著pH的增加，多糖提取率增加到最大值然后有所下降；pH不變，酶解時間增加，多糖提取率逐漸增大然后下降。這與單因素試驗分析結果一致。多糖提取率的變化速率顯示酶解時間主效應大于pH，與統計結果相符。

在試驗范圍內，酶濃度不變，隨pH的增加，多糖提取率增加到最大值然后有所下降；pH不變，酶濃度增加，多糖提取率逐漸增大然后下降。與單因素試驗分析相吻合。多糖提取率的變化速率顯示酶濃度主效應大于pH，與統計結果相符。

3.2.4最優工藝條件求取

為進一步確定最佳點值，對所得回歸方程取一階偏導為零，得到曲面的最大點，求導方程整理為:

-22-80A+3B-19C-7D=0

38+15A-320B-65C+100D=0

94-95A-65B-360C+52D=0

32-35A+100B+52C-320D=0

求解方程組得：A=-0.378 5；B=0.089；C= 0.374 5；D= 0.204 5。最后求得酶解溫度、酶解時間、酶濃度、pH分別為：a = 46.18℃，b=123min，c=3.38 %，d=9.20。此時蒲公英多糖的最大提取率為3.11 %。對提取條件進行中心組合設計優化，最佳提取工藝參數為：酶解溫度46.18℃、酶解時間123min，酶濃度3.38 %，pH= 9.2，此時多糖提取率理論值可達到3.07 %。驗證試驗表明，多糖提取率為3.11 %。

3.3酶解法與常規水煮法的對比試驗

在前面試驗基礎上確定了酶解法最優工藝，利用這些確定的參數與常規水煮法進行對比試驗。

準確稱取0.5 g蒲公英粉3份，分別置于100 mL錐形瓶中，然后加入蒸餾水50 mL，分別提取8 h，然后離心，合并上清液，并將上清液稀釋25倍，進行吸光度檢測。試驗結果見表4。

表4　兩種方法的多糖提取結果對比Table 4 Contrast of the extraction yield of Herba Taraxaci polysaccharides between two ways of extraction

由表4可知，酶解提取蒲公英中的多糖，其提取率遠遠優于傳統水解提取法。這與酶解對蒲公英細胞的破壞是均勻的，多糖較易溶出有關；而傳統水煮提取法盡管耗時很長（8 h），但細胞結構沒有遭到破壞，故而提取率較低。

4　結論

1）采用酶解法提取蒲公英多糖的提取率可達3.11%。

2）基于單因素試驗得到的較優工藝條件：pH為9.00，酶解溫度為50℃，酶解時間為120min，酶含量為3 %（酶質量/蒲公英質量）。

3）在單因素試驗的基礎上，酶解溫度、酶解時間、pH和酶含量選取4個因素進行中心組合設計，使用Design Expert 7.0.0軟件進行數據擬合，建立了酶解提取蒲公英中多糖的工藝數學模型Y=+3.07-0.11A+ 0.038B+0.094C+0.032D+0.015AB-0.095AC-0.035AD-0.065BC +0.10BD +0.052CD -0.20A2-0.16B2-0.18C2-0.18D2。回歸分析表明該模型穩定性較好；通過模型系數顯著性檢驗，得到因素的主效應關系為:酶濃度＞酶解時間＞酶解溫度＞pH值。

4）由響應面法得到的模型進行探討，蒲公英中多糖的酶解提取過程優化工藝：pH為9.2，酶解溫度為46.18℃，酶解時間為123min，酶含量為3.38 %（酶質量/蒲公英質量），在該優化條件下，提取率為3.11 %。驗證試驗表明，蒲公英多糖的提取率為3.08 %，與理論值相符。因此，響應面法優化工藝獲得的蒲公英多糖的酶解提取條件，數據準確，科學可行。

5）酶解法與常規水煮提取法的對比試驗表明，采用酶解法提取工藝提取蒲公英中的多糖，提取率高于常規水煮提取工藝。

參考文獻：

[1]鐘振聲,趙蓓蓓,孫昂.蒲公英抑菌物質的提取工藝研究[J].現代食品科技,2009,25(1):58

[2]許春平,楊琛琛,鄭堅強,等.植物葉多糖的提取和生物活性綜述[J].食品研究與開發,2014,35(14):111-114

[3]宋曉勇,劉強,楊磊,等.蒲公英多糖提取工藝及抗菌活性研究[J].中國藥房,2010,21(47):4453-4454

[4]童洋,肖國民,潘曉梅.響應面法優化螺旋藻中葉綠素的超聲提取工藝[J].化工學報,2009,60(11):2813-2818

[5]李娜,楊曉杰,李旭業,等.植物多糖提取技術研究[J].高師理科學刊,2012,32(2):87

[6] Shi S Y,Zhao Y,Zhou H H,et al.Identification of antioxidants from Taraxacum mongolicum by high-performance liquid chromatography-diode array detection -radicalscavenging detection -electrospray ionization mass spectrometry and nuclear magnetic resonance experiments[J].J Chromatogr A,2008,1209(1/2):145

[7]魏軍青,肖春玲,陸楠,等.酶解法提取黑豆多糖的研究[J].陜西農業科學,2013(1):6-10

[8]劉洋,李克劍,詹冬玲,等.木瓜蛋白酶輔助提取大蒜水溶性粗多糖的工藝[J].食品研究與開發,2013,34(20):26-29

[9]孟志芬,祝勇,張懷.木瓜蛋白酶酶解法提取大棗多糖的工藝研究[J].河南科技學院學報(自然科學版）2006,34(3):49-50

[10]徐鶴桐,陳野.基于響應面法提取花生蛋白工藝優化[J].食品研究與開發,2015,36(9):30-33,64

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Optimization of Extraction Technology of Polysaccharides from Herba Taraxaci by Enzymatic Hydrolysis

XU Lan1，WANGming-hua1，QU Juan-juan1，AN Wei2
（1.Department of Biology，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，Shanxi，China；2.Maize Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

Abstract：To optimize the extraction technology of polysaccharides from Herba Taraxaci，contrast experiment were carried out.The single factor experiment and Box-Behnken experiment were designed to study the effects of the pH，enzymolysis time，enzyme solution temperature，enzyme concentration on the extraction yield by enzymatic hydrolysis .On the basis of the type selection of enzyme，the optimum parameters of Herba Taraxaci polysaccharide extraction yield was determined.Results analysis of variance showed that enzyme concentration could have a greater impact on the extraction rate of polysaccharides，then was enzymolysis time and enzyme solution temperature，the last was the pH.The extraction yield by papaya protease was the highest（3.11 %）；The optimal conditions of extraction by enzymatic hydrolysis were:pH 9.20，enzyme solution temperature 46.18℃，enzymolysis time 123min，enzyme content 3.38 %（enzyme quality/quality of dandelion）.

Key words：Herba Taraxaci；polysaccharides；enzymatic hydrolysis；response surface methodology

DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.012

基金項目:公益性行業（農業）科研專項經費（201503124）；忻州師范學院大學生科技創新項目（自然科學類201428）；忻州師范學院青年基金項目（201208）

作者簡介:徐瀾（1975—），女（漢），副教授，博士，從事植物有效成分提取；旱作栽培與農業生態研究等。

收稿日期:2015-09-06