創建釀酒酵母細胞工廠發酵生產羽扇豆醇お

林庭庭 王冬 戴住波 張學禮 黃璐琦

[摘要]羽扇豆醇、樺木酸等羽扇豆型三萜化合物具有抗HIV、抗腫瘤等多種生物學活性，其中羽扇豆醇為這類化合物的基本前體。為了實現羽扇豆烷型三萜的異源發酵法生產，研究首先運用高通量同源重組法在釀酒酵母中進行萜類甲羥戊酸（MVA）途徑的一步法調控，以提高三萜通用前體鯊烯的供給；在進一步工作中，擬南芥來源的羽扇豆醇合成酶基因（AtLUP）被整入三萜底盤菌株中實現羽扇豆醇酵母人工細胞工廠的創建。結果表明該實驗能一次完成MVA途徑的7個基因的整合，組裝總長度達到20kb，同時多倍化MVA途徑能顯著提高鯊烯產量約500倍，達到35400 mg·L-1；AtLUP基因在染色體上整合后獲得的工程菌NK2LUP在搖瓶中發酵能生產823 mg·L-1羽扇豆醇。該研究可為在酵母中實施大規模生物合成途徑組裝提供技術支持，同時為進一步獲高產羽扇豆烷型三萜的人工酵母細胞提供了重要基礎。

[關鍵詞]三萜；羽扇豆醇；合成生物學；釀酒酵母

羽扇豆烷型（lupanetype）三萜是一類藥用植物中微量合成的五環三萜類次生代謝物，主要包括羽扇豆醇（lupeol）、樺木酸（betulinic acid）和相應的衍生物[1]。其中，羽扇豆醇是這類化合物生物合成的基本前體物質。在植物細胞中，它可以在P450氧化酶的催化作用下發生C28位氧化，依次轉化成樺木醇、樺木醛并最終氧化成樺木酸[24]。1995年Pisha等[5]發現了樺木酸具有較高選擇性的抗黑色素瘤活性后，其出色的抗HIV活性也被人們發現[67]。目前，樺木酸和樺木酸衍生物Bevirimat已作為抗黑色素瘤藥物或抗HIV的候選藥物進入臨床研究階段[8]，然而，樺木酸在樺木中的含量只有0025%[9]，新的資源途徑迫切需要解決。

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae是一種生物安全的模式真核生物，其遺傳背景清晰，遺傳改造策略及發酵方法成熟，已被廣泛應用于構建生產青蒿素[10]，人參皂苷[1112]，番茄紅素[13]和β胡蘿卜素[14]等天然萜類活性物質的底盤工程菌株。異戊烯焦磷酸（IPP，isopentenyl pyrophosphate）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP，dimethylallyl pyrophosphate）為萜類生物合成的基本單元，自然界可經乙酰輔酶A乙?；D移酶、羥甲基戊二酰輔酶A合酶、3羥基3甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶和異戊烯焦磷酸異構酶等7個酶組成的甲羥戊酸途徑（MVA pathway）合成。IPP和DMAPP可依次在法呢基焦磷酸合成酶和鯊烯合酶的催化作用下合成三萜通用前體鯊烯（squalene）。在釀酒酵母中，鯊烯可以繼續被鯊烯環氧酶氧化為環氧鯊烯（2，3oxidosqualene），繼而可以被羊毛甾醇環合酶等酶催化生成羊毛甾醇（lanosterol）和麥角固醇（ergosterol）等物質。在其他物種中，環氧鯊烯也可以被不同類型的環氧鯊烯環化酶催化生成各種類型的三萜母核，如β香樹脂，葫蘆二烯醇和羽扇豆醇等[1]，見圖1。其中，羽扇豆醇能被樺木酸合成酶催化生成樺木酸[24]。

在本研究中，首先運用高通量同源重組法在釀酒酵母CENPK21D中進行萜類甲羥戊酸（MVA）全途徑基因的一步法整合調控，實現多基因、超長度、高精度的基因組定點整合，獲得鯊烯（三萜通用前體）含量顯著提高的底盤菌；在此基礎上，通過整合擬南芥Arabidopsis thaliana來源的羽扇豆醇合成

酶基因（AtLUP），構建出羽扇豆醇的生物合成途徑，為構建高產羽扇豆烷型三萜釀酒酵母細胞工廠提供基礎，同時為酵母中實現大規模生物合成途徑精確組裝提供技術支持。

1材料

11工具酶與試劑PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自于大連寶生物工程公司；酵母基因組DNA提取試劑盒購自北京康為世紀有限公司；質粒小量快速提取試劑盒購自美國Axygen公司；氨芐青霉素、DNA清潔試劑盒與DNA回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母選擇培養基購自北京泛基諾科技有限公司；羊毛甾醇、麥角固醇、鯊烯和羽扇豆醇對照品購自美國SigmaAldrich公司；其他試劑均為分析純。

12質粒，菌株及引物本次研究所用的質粒，菌株及引物信息見表1，2。

13培養基LB培養基：1%蛋白胨，05%酵母粉，1%氯化鈉，100 mg·L-1氨芐青霉素；SM[Ura]篩選培養基：08%酵母選擇培養基（三缺，UraTrpHis），2%葡萄糖，001%Trp，001%His；SM[UraTrp]篩選培養基：08%酵母選擇培養基（三缺，UraTrpHis），2%葡萄糖，001%His；YPD培養基：2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖。上述液體培養基加2%的Agar可配成相應的固體培養基。

2方法

21NK2SQ系列菌株的構建構建NK2SQ系列工程菌株所采用的方法為多片段同源重組，見圖2，表3。首先，Group A中模板和引物的搭配方案，用PrimeSTAR HS高保真聚合酶擴增和割膠回收得到用于同源重組的各個片段。用YPD培養基活化CENPK21D（以下簡稱NK2）后將各個片段利用醋酸鋰法轉入感受態中[11]，并用SMUra固體培養基篩選轉化子。轉化子再分別用SacIIPGK1/HMG1Asc，PacPDC1p/ERG12Asc，PacENO2p/IDI1Asc，PacPYK1p/ERG19Asc，PacpFBA/ERG13Asc，PacpTDH3/ERG8Asc ，SacIIpTEF1/ERG10Asc，SexAHMG1/PDC1pSexA1，SexA1ERG12/ENO2pSexA1，SexA1IDI1/PYK1pSexA1，SexA1ERG19/pFBASexA1，SexA1ERG13/pTDH3SexA1，SexA1ERG8/pTEF1SexA1等13對引物對途徑進行PCR驗證和測序驗證，得到工程菌NK2SQ。同時在NK2菌株的GAL7位點整合URA3篩選標記，獲得對照菌NK2SQCK，見表1。

22NK2LUP系列菌株的構建構建NK2LUP工程菌株所采用的方法與21相同，見圖3，表3。首先，Group B中模板和引物的搭配方案，用PrimeSTAR HS高保真聚合酶擴增和割膠回收得到用于同源重組的各個片段。然后用SMUra培養基活化NK2SQ菌株并利用醋酸鋰方法制備成感受態細胞，將各個片段轉入感受態中[11]，用SMUraTrp固體培養基篩選轉化子。轉化子用引物SacIIPGK1/LUPAsc進行PCR驗證和測序驗證后，得到工程菌NK2LUP，見表1。

23搖瓶發酵方法及產物提取方法挑取平板上的單克隆于相應液體培養基中，30 ℃，250 r·min-1。將種子液接種于含15 mL YPD培養基的100 mL的三角瓶中，30 ℃，250 r·min-1振蕩培養6 d后，進行產物的提取。產物提取的方法如下：取2 mL的發酵液于破碎管中，13×103 r·min-1離心3min，去培養基，無菌水清洗后，加入適量玻璃珠（直徑為05 mm）和05 mL丙酮，震蕩破碎5 min，

超聲破碎30 min，13×103 r·min-1離心3 min，取上清。重復處理第2次，合并上清。上清過022 μL有機尼龍濾膜后備用。

24鯊烯及羽扇豆醇的檢測方法GCMS測定：進樣口溫度300 ℃，進樣體積1 μL，不分流，溶劑延時12 min；色譜柱HP5 ms（025 mm×30 m）；色譜條件為80 ℃，1 min；20 ℃·min-1到300 ℃保溫18 min；MS條件為SIM 69，109，135，363，411；羊毛甾醇，麥角固醇、鯊烯和羽扇豆醇標準品用于定性和定量分析。

3結果與分析

31一步法完成多倍化MVA生物合成途徑植物天然產物的生物合成涉及到多步酶促反應，如從倍半萜共同前體FPP開始合成青蒿素前體青蒿酸就需要6條功能基因參與[10]；另外，紫杉醇和嗎啡等化合物的酶反應步驟均超過10步[1516]。因此，在微生物細胞工廠構建過程中實現基因的高通量重組顯的十分重要。在本研究中，嘗試對由7個功能基因組成的MVA合成途徑進行一步法組裝：首先將MVA途徑中的ERG10，ERG13，tHMG1，ERG12，ERG8，ERG19和IDI1 7個基因進行PCR克隆，并分別與相應的強啟動子TEF1，FBA1，PGK1，PDC1，TDH3，PYK1，ENO2和終止子連接后，利用同源重組一次整合到NK2基因組的GAL7位點（URA3為篩選標記）。轉化子經過缺陷培養基的篩選后，分別用相應的引物對整合途徑進行PCR和測序驗證后得到工程菌NK2SQ。PCR和測序結果顯示，該方法可在釀酒酵母中一次性完成9個基因片段，約20 kb總基因長度的整合，見圖2，4。

MTrans2K plus marker；左圖泳道1～77個基因及相應的啟動子的PCR產物條帶；左圖泳道8～13驗證7個基因是否串聯在一起的PCR產物條帶；右圖泳道1URA3 marker整合到NK2SQCK菌株PCR驗證結果。

32MVA途徑的優化對釀酒酵母萜類產量的影響MVA途徑作為細胞中乙酰輔酶A轉化為萜類化合物的第1個關鍵模塊，其活性會直接影響到細胞中萜類產量[17]。經過對工程菌NK2SQ中鯊烯、羊毛甾醇和麥角固醇等萜類產量的分析發現：MVA途徑的多倍化能顯著提高菌株NK2SQ萜類的合成能力，其中三萜通用前體物質鯊烯的產量達到（35400±228）mg·L-1，較對照菌NK2SQCK提高了500倍，見圖5。另外麥角固醇和羊毛甾醇等下游萜類含量變化不顯著，可能是由于釀酒酵母內源的麥角固醇生物合成途徑受到嚴格調控所致[18]。

33羽扇豆醇細胞工廠構建及產物分析鯊烯可在酵母內源的環氧鯊烯合酶催化下形成2，3環氧鯊烯，在釀酒酵母中引入擬南芥來源的羽扇豆醇合成酶可催化2，3環氧鯊烯環化形成羽扇豆醇[24]。首先，將通過密碼子優化和全基因合成的AtLUP基因，與強啟動子PGK1和終止子ADH1連接后，整合到三萜底盤菌株NK2SQ基因組的HIS3位點（TRP1為篩選標記），轉化子經過缺陷培養基的篩選及PCR與測序驗證后得到工程菌NK2LUP，見圖

3，6。NK2LUP在YPD培養基中發酵6 d后，利用GCMS對發酵產物進行定性和定量分析發現工程菌株NK2LUP能發酵生產羽扇豆醇，見圖7。其產量達到（823±118） mg·L-1見圖8；與出發菌NK2SQ相比，三萜的通用前體鯊烯和其內源衍生物羊毛甾醇和麥角固醇的總量未見明顯改變，分別為40726，41332 mg·L-1，但中間體鯊烯的積累依然很充足，產量為（35335±378） mg·L-1，見圖8。

4討論

目前，雖然人們發現樺木酸等羽扇豆烷型三萜具有很出色的抗癌、抗HIV等生物學活性[1920]，但是此類化合物基本都是從植物中直接提取，對植物資源有很高的依賴性和破壞性。釀酒酵母為安全的模式真核生物，含有可供萜類合成的MVA途徑，且利用釀酒酵母生產萜類化合物也已經有了很多成功的案例，如科學家們已構建了生產青蒿酸[10]、丹參酮[21]、人參苷元[1112]等萜類化合物的釀酒酵母細胞工廠。本研究中，首先通過一步法在釀酒酵母中實現了約20 kb基因長度的MVA途徑精確重組，構建了高產鯊烯的三萜底盤釀酒酵母細胞工廠NK2SQ。然后，將擬南芥來源的AtLUP基因整合至底盤菌株NK2SQ基因組中，創建了可生產羽扇豆烷的釀酒酵母細胞工廠NK2LUP。然而，目前工程菌株中羽扇豆醇的轉化率及產量均很低，這一現象可能是環氧鯊烯合酶（ERG1）是三萜合成途徑中的一個限速酶[11]，未過表達ERG1導致羽扇豆醇合酶AtLUP的底物2，3環氧鯊烯供給不足造成的；亦或是植物源蛋白AtLUP在釀酒酵母中進行異源表達且只有單個拷貝時，酶活及表達量不足造成的；亦或是二者兼而有之。下步工作將主要圍繞鯊烯至羽扇豆醇的代謝途徑進行優化。本研究完成了羽扇豆醇釀酒酵母人工細胞工廠的構建，為進一步獲得羽扇豆烷型三萜細胞工廠提供了基礎，同時為酵母中實現大規模生物合成途徑精確組裝提供技術支持。

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[責任編輯呂冬梅]