靈芝DNA甲基轉移酶（GlMET1）基因克隆及原核表達誘導分析

查良平 王亞君 劉爽 趙玉洋 袁媛 黃璐琦

[摘要]DNA甲基轉移酶是DNA甲基化過程中最關鍵的酶，對生物體內的基因表達調節起著重要作用。研究根據靈芝轉錄組數據，通過全基因合成首次克隆得到靈芝DNA甲基轉移酶GlMET1，Genbank注冊號為KU239998，并對其基因特性和空間結構進行全面的生物信息學分析。原核表達誘導分析表明pET28a（+）GlMET1重組質粒在BL21（DE3）中能成功表達出目的蛋白，對其誘導條件進行優化，得出蛋白最合適的表達條件為：誘導溫度為16 ℃，重組菌生長25 h（A600為08），IPTG濃度為02 mmol·L-1，誘導時間為12 h。實時熒光定量PCR結果表明不同品種靈芝GlMET1的基因表達水平均有明顯差異，且GlMET1在成熟期的表達水平均低于幼年期，說明GlMET1表達量隨著靈芝的生長發育呈下降趨勢。該研究結果為深入研究DNA甲基轉移酶蛋白的作用機制奠定了基礎。

[關鍵詞]靈芝；甲基化；甲基轉移酶；基因克??；原核表達

表觀遺傳修飾是指不改變DNA序列的可遺傳的對堿基和組蛋白的化學修飾，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑以及非編碼RNA等[1]。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，在生物體內的基因表達調節方面起著重要作用，如參與轉座子沉默，基因印跡和X染色體失活等生物學過程。DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶的催化下完成的，甲基轉移酶將SAM的甲基基團轉移到胞嘧啶的5位碳原子上從而完成甲基化過程[2]。DNA 甲基化反應的催化劑DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，Dnmt） 在染色質重塑和基因表達調控中起著關鍵作用。目前在植物中至少已經發現3種DNA甲基轉移酶，即甲基轉移酶l （methyltransferas，METl）、結構域重排甲基轉移酶（domains rearranged methyltransferas，DRM）和染色質甲基化酶（chromomethylase 3，CMT3） [35]。MET1被認為是具有統治地位的 DNA 甲基轉移酶，它具有使核苷酸序列中CG堿基的胞嘧啶的甲基化的作用，同時METl能夠影響植物的形態特征、調控開花的時間等[6]。

中藥靈芝G lucidum是食藥兼用的一種真菌植物，含有多糖、萜類化合物、生物堿、核苷、氨基酸多肽和微量元素等多種活性成分，其中靈芝多糖和三萜類化合物是靈芝的主要活性成分，研究表明它們具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和降血糖等多種生物活性[79]。自20世紀80年代以來，對靈芝的分子生物學、次生代謝產物和藥理等均進行了深入的研究，尤其是圍繞靈芝三萜酸生物合成相關基因的篩選、克隆和功能分析已有大量報道，轉錄組和基因組信息為研究靈芝基因組多樣性奠定了基礎，靈芝被認為是研究真菌次生代謝的理想模式物種[1011]。目前已從多種植物中分離克隆出METl酶基因，如擬南芥[12]、玉米[13]、草莓[14]、馬鈴薯[15]等，但藥用植物的MET1酶基因報道較少。本研究首次從靈芝轉錄組中篩選得到靈芝DNA甲基轉移酶基因GlMET1，采用全基因合成克隆得到其cDNA序列，對其基因特性和空間結構進行全面的生物信息學分析，并構建pET28a（+）GlMET1重組質粒，轉換至表達菌BL21（ DE3）中，對影響蛋白表達的誘導溫度、誘導時間、IPTG濃度及宿主菌吸光度等4個因素進行了優化，同時采用實時熒光定量PCR檢測不同品種和不同生長時期的GlMET1表達水平，為進一步研究DNA甲基轉移酶基因的功能及其在靈芝發育過程中的調控功能奠定基礎。

1材料與方法

11藥材

霍芝1號采自于安徽省六安市霍山縣衡濟堂公司，赤芝10號采自于安徽省六安市霍山縣一品堂公司，金芝1號采自于安徽省六安市金寨縣喬康藥業，野生靈芝采自于安徽省金寨縣鐵沖鄉。經安徽中醫藥大學藥學院彭華勝教授鑒定，樣品經鑒定后保存于-80 ℃冰箱。

12菌株、載體和試劑

大腸桿菌BL21（DE3）為本實驗室保存。原核表達載體pET28a（+）為本實驗室保存；DNA測序由北京睿博生物科技公司完成，寡核苷酸引物由上海生工生物工程公司合成。限制性內切酶購自NEB有限公司。

13總RNA 提取及cDNA的合成

稱取100 mg左右靈芝新鮮的子實體，加液氮置于球磨機上研磨，采用CTAB法從新鮮的子實體中提取總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳用于評價RNA的質量。ND2000測定總RNA的A260，A280，選擇A260/A280為18～20的總RNA反轉錄成cDNA。

14GlMET1全基因合成及原核表達載體構建

靈芝DNA甲基轉移酶1（GlMET1）的基因來源于靈芝轉錄組數據庫。選擇整條序列的3 554個堿基作為克隆的對象，在引物的兩端各設計了BamHI和SalI酶切位點和保護性堿基，序列總全長為3554 bp，全基因合成由江蘇蘇州泓迅生物科技有限公司完成。對帶有酶切位點的GlMET1和pET28a（+）載體分別進行雙酶切，利用T4 DNA連接酶進行連接，25 ℃連接3 h。將連接產物轉化至DH5α感受態細胞，在含有卡那霉素的LB培養板上37 ℃。挑單克隆菌液PCR，雙酶切和測序鑒定。

15GlMET1的生物信息學分析

將測序獲得的序列結果使用ORF Finder （http：//wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml）查找開放閱讀框（ORF）。利用在線工具Protparam （http：//wwwexpasych/tools/protparamhtml）預測基因編碼蛋白的相對分子量、氨基酸數目、等電點、不穩定系數、脂肪指數、親水性/疏水性和編碼區全長等理化性質；采用CDD（http：//wwwncbimlmnihgov/Structure/cdd/wrpsbcgi）進行蛋白質結構域分析；采用CFSSP（http：//wwwbiogemorg/tool/choufasman/）進行蛋白質二級結構分析；利用Swiss Model（http：//swissmodelexpasyorg/）程序，根據基因氨基酸序列進行建模，預測蛋白質的三級結構。用DNAMAN軟件對序列進行多重比對以及限制性酶切位點的預測，用ClustalW軟件與其他植物的氨基酸序列進行比較，用MEGA 606軟件構建Neighborjoining系統進化樹，bootstrap 重復次數為1 000次。

16pET28a（+）GlMET1的原核表達及條件優化

將構建好的pET28a（+）GlMET1質粒轉化到BL21（DE3）表達感受態中，進行轉化表達宿主菌。取轉化表達菌液按照1∶100加到含卡那霉素抗性的LB培養液中，37 ℃ 250 r·min-1振蕩培養約25 h至A600 04～06，加IPTG于16 ℃低溫誘導12 h，收集菌體，加入等體積的2×loading buffer 煮沸，上樣，用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行SDSPAGE分析。針對誘導溫度、誘導時間、IPTG濃度，及IPTG添加時間（ 即誘導起始菌液濃度A600） 等4個因素對原核表達產物的積累有一定影響，分析了這4個因素對靈芝DNMT1重組蛋白表達的影響。

17Realtime PCR

從轉錄組中數據中獲取靈芝內參照GlGPD和GlMET1的核苷酸序列，利用Primer Premier 50設計實時熒光定量引物，擴增產物長度在100～250 bp，送由生工生物工程（上海）公司合成，其中GPD上游引物為5′CGCTCAACAAGAACTTCGTCAA3′，GPD下游引物為5′CGTAGACAAGGAGGTCACAGA3′，GlMET1上游引物為5′ATCGATCCAACGGCAAAG3′，GlMET1下游引物為5′CACAGAAGACGAACGAATCC3。反應體系： 5 μL 2×SYBR green，02 μL ROX Reference Dye，02 μL引物1，02 μL引物2，10 μL cDNA，34 μL H2O。PCR 反應條件為： 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個擴增循環；dissociation stage。在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行熒光定量，結束后分析熔解曲線。各基因表達量以內參基因作為標準進行相對定量，每個反應重復3次，相對定量方法采用2-ΔCT法分析結果。

2結果

21GlMET1基因的全基因合成及生物信息學分析

依據靈芝轉錄組數據獲得靈芝GlMET1的cDNA，利用DNAMAN軟件結合ORF Finder在線軟件對GlMET1基因全長cDNA 序列進行分析， 預測其含3 554 bp完整的開放閱讀框，通過全基因合成技術完成GlMET1的克隆，其測序結果與預測結果相一致。NCBI BLASTX 顯示GlMET1與污叉絲孔菌Dichomitus squalens 65%相似，云芝Trametes versicolor 46%相似，粉孢革菌Coniophoraputeana 42%相似。比對表明所獲基因屬于MET1家族，將該基因命名為GlMET1，GenBank注冊號為KU239998。

利用NCBI的 Conserved domains在線工具分析GlMET1蛋白的功能結構域，結果表明GlMET1具有4個功能域：39～166 aa的肽端與DNMT1RFD super family有較高的同源性，365～496 aa與39～637 aa均為保守的BAH結構域，700～1 160 aa與Dcm家族有較高的同源性。利用在線生物學工具TMHMM20 Server對進行蛋白跨膜結構域預測分析，結果顯示無跨膜區。使用ExPASy在線服務器的SWISSMODEL Homology Modeling對GlMET1蛋白進行同源建模，得到了蛋白的三維空間模型，GlMET1蛋白模型4yoc1A得分為062，蛋白序列的相似性為2599%，見圖1。

22GlMET1序列家族同源基因的系統進化分析

將GlMET1與GenBank中20種其他植物的同源蛋白進行比對， 在軟件MEGA 606平臺上采用相鄰連接法構建進化樹， 進行聚類關系分析，見圖2。從進化樹中，可以得知不同類植物在進化樹中分別聚成不同的分支，雙子葉植物的GlMET1聚為一個分支，進而與單子葉植物的MET1聚為一個大的分支，與GlMET1親緣關系最近的為真菌植物Termitornyces sp和Moniliophthora roreri， 藻類植物的MET1與所有植物親緣關系最遠。

23pET28a（+）GlMET1原核誘導表達

將構建的pET28a（+）GlMET1質粒轉化至表達菌BL21（ DE3） 中，加入IPTG誘導表達，所得菌體經離心煮沸后進行SDSPAGE蛋白電泳分析，見圖3。結果表明在149 kDa處出現目的蛋白條帶，GlMET1基因的cDNA由3 545個堿基組成，編碼133 kDa蛋白，原核表達載體pET28a上的HisTag標簽大小為16 kDa，所以重組表達載體編碼蛋白大約為149 kDa； 而陰性對照E coli[pET28a]誘導表達后在149 kDa處沒有條帶出現，表明含有GlMET1基因的重組質粒，在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達。

At擬南芥Arabidopsis thaliana （NP_1997271）；At節節麥Aegilops tauschii（EMT234551）；Ca鷹嘴豆Cicer arietinum；Ci野菊花Chrysanthemum indicum；Cs亞麻薺Camelina sativa；Gs大豆Glycine soja；Mn川桑Morus notabilis；Mt蒺藜苜蓿Medica gotruncatula；Mr Moniliophthora roreri；Nt煙草Nicotiana tabacum；Os水稻Oryza sativa Japonica Group；Ot 綠藻Ostreococcus tauri；Pt毛果楊Populus trichocarpa； Pp巴旦木Prunus persica； Pp小立碗蘚Physcomitrella patens；Sl番茄Solanum lycopersicum； Si小米Setaria italica； Tc可可Theobroma cacao；Vv葡萄Vitis vinifera；TsTermitornyces sp。

24pET28a（+）GlMET1表達條件的優化

241誘導溫度對pET28a（+）GlMET1蛋白表達的影響保持誘導時間12 h， IPTG濃度為04 mmol·L-1， A600為06不變，觀察不同誘導溫度16，20，25，30，37 ℃對pET28a（+）GlMET1蛋白表達的影響，見圖4。溫度為16，20 ℃時，pET28a（+）GlMET1有表達，且誘導溫度為16 ℃時的表達量更高，但隨著溫度繼續上升，pET28a（+）

M蛋白質Marker； C： Escherichia coli[pET28a]；1未誘導的E coli[pET28a（+）GlMET1]； 2誘導后的E coli[pET28a（+）GlMET1]。

GlMET1在25，30，37 ℃均未產生表達，表明該蛋白適合低溫誘導，最合適溫度為16 ℃。

M.蛋白質Marker； C.Escherichia coli[pET28a]；15E coli[pET28a（+）GlMET1]，誘導溫度分別為16，20，25，30，37 ℃。

242誘導時間對pET28a（+）GlMET1蛋白表達的影響保持誘導溫度16 ℃，IPTG濃度為04 mmol·L-1，A600為06不變，觀察不同誘導時間2，4，8，12，24 h對pET28a（+）GlMET1蛋白表達的影響，見圖5。隨著誘導時間增加，pET28a（+）GlMET1表達呈增加趨勢，在誘導時間為12 h時其表達量最高，說明誘導時間有利于目的蛋白的表達。

M.蛋白Marker； C.Escherichia coli[pET28a]；1～5E coli[pET28a（+）GlMET1]，誘導時間分別為2，4，8，12，24 h。

243IPTG濃度對pET28a（+）GlMET1蛋白表達的影響保持誘導溫度16 ℃，誘導時間12 h，A600為06不變，觀察不同IPTG濃度0，01，02，04，06，08，10 mmol·L-1對pET28a（+）GlMET1蛋白表達的影響，見圖6。隨著IPTG濃度增加，pET28a（+）GlMET1表達沒有明顯變化，說明高濃度的IPTG不能增加目的蛋白的表達，低濃度的IPTG反而有利于目的蛋白的表達。

M蛋白Marker； C.Escherichia coli[pET28a]；1～7E coli[pET28a（+）GlMET1]，IPTG濃度分別為0，01，02，04，06，08，10 mmol·L-1。

圖6pET28a（+）GlMET1在不同IPTG濃度處理下的表達

Fig6Expression of pET28a（+）GlMET1 protein at different IPTG concentration

244宿主菌吸光度A600對pET28a（+）GlMET1蛋白表達的影響保持誘導溫度16 ℃，誘導時間12 h， IPTG濃度為04 mmol·L-1不變，選擇誘導時宿主菌的吸光度（A600）分別為02，04，06，08和1時，觀察pET28a（+）GlMET1蛋白的表達，見圖7。隨著宿主菌的吸光度（A600）增加，pET28a（+）GlMET1表達先上升后下降，在A600為08的時候目的蛋白的表達最高。

M蛋白Marker； C.Escherichia coli[pET28a]；1～5 E coli[pET28a（+）GlMET1]，宿主菌的吸光度（A600）分別為02，04，06，08，1。

圖7pET28a（+）GlMET1在不同宿主菌密度下的表達

Fig7Expression of pET28a（+）GlMET1 protein in different culture densities before IPTG induction

25靈芝GlMET1的基因表達水平分析

為進一步了解靈芝甲基轉移酶基因的表達模式，本研究通過Realtime PCR技術對安徽大別山區靈芝的3個栽培品種和1個野生品種進行了表達差異分析，見圖8。結果顯示GlMET1在不同品種靈芝中的表達水平有明顯差異，且在不同生長時期也有差異。一方面，GlMET1在不同品種間的表達量依次為野生靈芝>霍芝1號>金芝1號>赤芝10號；另一方面，不同發育時期的GlMET1表達水平在4個品種中均表現出成熟期低于幼年期，說明GlMET1表達量隨著靈芝的生長發育呈下降趨勢。

3討論

DNA甲基轉移酶在植物和真菌的生長發育過程中具有重要的表觀遺傳調控作用，被認為是表觀遺傳中最關鍵酶之一。本研究首次通過靈芝轉錄組克隆得到靈芝DNA甲基轉移酶GlMET1，并利用生物信息學的方法對其核酸及其推測的蛋白序列組成進行分析，對構建的pET28a（+）GlMET1重組質粒進行了原核表達蛋白優化分析，同時分析了不同生長時期及不同品種靈芝GlMET1的基因表達水平，

為深入研究DNA甲基轉移酶蛋白的作用機制奠定了基礎。

本研究將GlMET1基因與原核表達載體pET28a（+）構建了融合表達載體，并成功地在大腸桿菌BL21（DE3）中實現表達，對影響蛋白表達的四大因素誘導溫度、誘導時間、IPTG濃度及誘導起始菌液濃度A600進行了優化分析，確定了pET28a（+）GlMET1蛋白最合適的表達條件為：誘導溫度為16 ℃條件下，重組菌生長25 h（A600為08）時，IPTG濃度為02 mmol·L-1，誘導時間為12 h時，蛋白的表達量最高。這為后續研究GlMET1的蛋白功能奠定了基礎。

在植物中第1個克隆的編碼DNA甲基轉移酶的基因MET1是在模式植物擬南芥中發現的，多項研究表明MET1的功能主要是維持DNA序列上的CG甲基化。擬南芥中MET1家族有4個成員，即METl，MET2a，MET2b以及MET3，且不同基因轉錄水平有較大不同，METl基因只在分生組織中轉錄，而MET2a，MET2b這2個基因的轉錄能夠發生在所有組織中[12，16]。研究表明MET1類基因的在植物的特定器官中表達易受環境脅迫的影響，玉米不同組織中DNA甲基轉移酶基因（ZmMET1） 的轉錄水平在冷脅迫條件下差異很大， 其中該基因在中胚軸中轉錄水平比較高， 而在根中幾乎不表達[13]。本研究對不同品種和不同生長時期的靈芝MET1表達水平進行檢測，發現GlMET1在不同品種靈芝中的表達水平有明顯差異，且在幼年時期的表達水平均高于成熟時期，這暗示在靈芝的生長發育過程中MET1基因可能發揮著調控作用，具體調控機制有待深入研究。

[致謝]在靈芝樣品收集過程中，得到安徽霍山衡濟堂公司、安徽霍山一品堂公司和安徽金寨喬康藥業的幫助。

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[責任編輯呂冬梅]