野燈心草地上部分菲類成分及其抗焦慮作用研究お

孫璐 付茜 張嬋溪 王小紅 王勤輝 龐歡歡 江美芳 黃建梅

[摘要]運用正相硅膠、Sephadex LH20、聚酰胺、制備型HPLC等多種色譜方法從野燈心草地上部分分離純化得到10個菲類化合物和4個其他類化合物。經質譜、NMR譜圖解析鑒定結構，分別為厄弗酚（1）、燈心草酚 （2）、juncuenin D （3）、去氫厄弗酚（4）、去氫燈心草酚（5）、juncuenin B （6）、dehydrojuncuenin B（7）、2甲氧基7羥基1甲基5乙烯基菲（8）、2羥基7羧基1甲基5乙烯基9，10二氫菲（9）、2羥基7羧基1甲基5乙烯基菲（10）、木犀草素（11），香草酸（12）、瑞香素（13）、對香豆酸（14）。其中，化合物13為首次從該屬植物中分離得到，化合物5，8～12為首次從該植物中分離得到。采用小鼠高架十字迷宮實驗評價菲類化合物6和7的抗焦慮活性，結果表明化合物6和7均具有抗焦慮作用。

[關鍵詞]野燈心草；菲類成分；高架十字迷宮；抗焦慮作用

野燈心草Juncus setchuensis Buchen為燈心草科燈心草屬植物，主要分布于我國西南地區，生長在海拔800～1 700 m的山溝、林下濕地、道路溪旁淺水處[1]。野燈心草具有與燈心草類似的功效，能利水通淋，泄熱安神，主治熱淋，腎炎水腫，心熱煩躁，心悸失眠等癥，其入藥部位為根、根莖或全草[2]。目前已從野燈心草中分離鑒定出菲類、黃酮類、丹參酮類、生物堿類、有機酸類等成分[35]。本課題組前期研究表明，燈心草中所含的菲類成分具有抗焦慮活性，為其功效清心除煩的物質基礎[68]，為深入研究燈心草屬植物菲類成分抗焦慮作用的構效關系，本實驗對野燈心草地上部分菲類成分進行研究，從中共分離得到10個菲類化合物和4個其他類化合物，并對分離得到的菲類成分進行抗焦慮活性評價。

1材料

柱色譜硅膠（80～100目，200～300目，300～400目），柱色譜聚酰胺（60～80目）和薄層色譜硅膠G板均為青島海洋化工廠生產；Sephadex LH20購于Pharmacia公司；顯色劑為10%濃硫酸的乙醇溶液（自制），其余試劑均為分析純；地西泮，純度>97%，批號880801，江西第四制藥廠；羧甲基纖維素鈉，分析純，批號011220，北京市旭東化工廠。

IsolearOne快速制備色譜（biotage公司）；ZF20D 型暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；Avance 500核磁共振儀（Bruker AG）；LC20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；Thermo BDS HYPERSIL C18柱（10 mm×250 mm，5 μm）；Thermo Fisher Scientific TSQ Quantum 三重四級桿液質聯用儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Xevo G2S QTof液質聯用儀（沃特斯公司）；Sartorius精密電子天平（德國賽多利斯公司）。

野燈心草J setchuensis于2013年12月采自福建武夷山，經中國科學院植物所標本室林祁教授鑒定。

SPF級KM小鼠，雄性，體重（20±2） g，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司（SCXK（京）20110004）。

2提取與分離

9 kg野燈心草（福建武夷山）地上部分，切小段（約3 cm），粉碎，以15倍量80%乙醇回流提取2次，合并提取液，濃縮，真空干燥，得到乙醇提取物148 kg。經硅膠（80～100目）拌樣，石油醚、乙酸乙酯、甲醇分別洗脫，得到乙酸乙酯部位浸膏69 g。利用快速制備色譜對乙酸乙酯部位進行分離。快速制備色譜條件為SNAP 340 biogage色譜柱，流動相為石油醚（A）醋酸乙酯（B），梯度洗脫0～15（柱體積，CV），16%B；15～8 CV，37% B；流速80 mL·min-1，檢測波長254，270 nm，菲類成分在檢測波長處有紫外吸收，得到3個組分F1～F3。

將F2組分125 g進行硅膠柱色譜分離，以石油醚醋酸乙酯（5∶2）進行洗脫，得到8個子流分（F201～F208）。組分F204經硅膠柱（二氯甲烷甲醇2∶001）分離，得到6個組分F2041～F2046。F2043先以硅膠柱（正己烷丙酮5∶15）分離得到組分F20433，經硅膠柱（二氯甲烷甲醇10∶002）純化得到化合物2（100 mg）；組分F2042用Sephadex LH20（甲醇）分離純化，得到化合物8（3 mg）。組分F205經硅膠柱分離（環己烷二氯甲烷醋酸乙酯5∶1∶1）得到7個組分F2051～F2057，F2054經硅膠柱分離（二氯甲烷甲醇5∶001）得到組分F20543和F20544，分別經硅膠柱（二氯甲烷甲醇5∶008和石油醚丙酮5∶1）分離，得到化合物1（71 mg）、化合物5（11 mg）；F2056經聚酰胺柱色譜分離（60%甲醇）和Sephadex LH20（100%甲醇）純化，得到化合物6（100 mg）。組分F206經硅膠柱（環己烷二氯甲烷醋酸乙酯5∶1∶2）分離，得到組分F2063，經硅膠柱（二氯甲烷甲醇10∶007）多次分離，得到化合物4（15 mg）。組分F207經硅膠柱色譜（環己烷二氯甲烷醋酸乙酯5∶1∶2）分離得到F2073與F2075，F2073經硅膠柱（二氯甲烷甲醇10∶025）和Sephadex LH20（100%甲醇）分離純化，得到化合物7（4 mg）；組分F2075直接由Sephadex LH20（100%甲醇）分離得化合物3（1 mg）。

組分F3經硅膠柱分離（二氯甲烷甲醇10∶025）得到8個組分F301F308，其中F306在甲醇中析出棕色方塊狀結晶，為化合物14（41 mg）。F304經硅膠柱分離（環己烷丙酮醋酸5∶15∶01）得到組分F3044和F3045，F3044用硅膠柱（二氯甲烷甲醇醋酸10∶004∶01）分離后，經制備HPLC[甲醇水（001%甲酸）]分離純化得到9（2 mg），10（1 mg）；F3045經硅膠柱分離（二氯甲烷甲醇醋酸10∶005∶01）得化合物12（52 mg）；F305經硅膠柱分離（二氯甲烷甲醇10∶025）得到組分F3054和F3055，F3054經Sephadex LH20（100%甲醇）分離，得到化合物13（7 mg）；F3055經硅膠柱多次分離（二氯甲烷甲醇醋酸10∶03∶01）得到化合物11（9 mg）。

3結構鑒定

化合物1淡黃色結晶（甲醇），HRESIMS m/z 251114 28[M-H]-， 1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 720（1H，d，J=82 Hz，H4），665（1H，d，J=85 Hz，H3），686（1H，d，J=20 Hz，H6），666（1H，d，J=20 Hz，H8），694（1H，dd，J=110，170 Hz，H12），565（1H，dd，J=174，1 Hz，H13），521（1H，dd，J=110，10 Hz，H13），266（4H，m，H9，10），222（3H，s，H11）。化合物1的波譜數據與文獻[9]中報道一致，鑒定為厄弗酚。

化合物2深黃色結晶（甲醇），HRESIMS m/z 265130 58[M-H]-，1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ：741（1H，d，J=84 Hz，H4），658（1H，d，J=84 Hz，H3），664（1H，s，H8），679（1H，dd，J=179，115 Hz，H12），545（1H，dd，J=114，20 Hz，H13），516（1H，dd，J=181，2 Hz，H13），261（4H，m，H9，10），223（3H，s，H11），219（3H，s，H14）。化合物2的波譜數據與文獻[9]中報道一致，鑒定為燈心草酚。

化合物3黃色粉末（甲醇），1HNMR（DMSOd6，500 MHz） δ： 738（1H，d，J=85 Hz，H4），676（1H，d，J=85 Hz，H 3），670（1H，dd，J=181，119 Hz，H12），578（1H，dd，J=119，21 Hz，H13），570（1H，dd，J=181，21 Hz，H13），633（1H，s，H5），283（4H，m，H9，10），970（1H，br s，OH），554（1H，br s，OH），202（3H，s，H11），193（3H，s，H12）。化合物3的波譜數據與文獻[10]中報道一致，鑒定為juncuenin D。

化合物4黃色粉末（甲醇），HRESIMS m/z 249100 56[M-H]-，1HNMR（CD3COCD3，500 MHz） δ： 851（1H，d，J=91 Hz，H4），791（1H，d，J=92 Hz，H10），766（1H，d，J=92 Hz，H9），727（1H，d，J=25 Hz，H6），723（1H，d，J=25 Hz，H8），722（1H，d，J =92，H3），749（1H，dd，J=173，107 Hz，H12），576（1H，dd，J= 172，15 Hz，H13），545（1H，dd，J=108，15 Hz，H13），259（3H，s，H11）。化合物4的波譜數據與文獻[11]中報道一致，鑒定為去氫厄弗酚。

化合物5深黃色結晶（甲醇），HRESIMS m/z 263114 43[M-H]-，1HNMR（CD3COCD3，500 MHz） δ： 889（1H，d，J=95 Hz，H4），712（1H，d，J =90，H3），784（1H，d，J=90 Hz，H10），758（1H，d，J=90 Hz，H9），727（1H，s，H8），735（1H，dd，J=180，110 Hz，H12），576（1H，dd，J=100，15 Hz，H13），545（1H，dd，J=180，15 Hz，H13），256（3H，s，H11），242（3H，s，H14）。化合物5的波譜數據與文獻[12] 中報道一致，鑒定為去氫燈心草酚。

化合物6白色結晶（甲醇），HRESIMS m/z 265130 58[M-H]-，1HNMR（CD3OD，500 MHz）δ： 735（1H，d，J=83 Hz，H4），705（1H，s，H5），671（1H，d，J=80 Hz，H3），678（1H，dd，J=178，115 Hz，H12），558（1H，d，J=113 Hz，H13），515（1H，d，J=179 Hz，H13），271（4H，m，H9，10），218（3H，s，H11），217（3H，s，H14）。13CNMR（CD3OD，125MHz） δ：1564（C2），1554（C6），1395（C1a），1388（C8），1371（C12），1356（C5α），1285（C8α），1263（C4α），1231（C4），1223（C1），1216（C7），1203（C13），1141（C3），1100（C5），272（C10），269（C9），134（C11），119（C14）。化合物6的波譜數據與文獻[10]中報道一致，鑒定為juncuenin B。

化合物7淡黃色片狀晶體（甲醇），HRESIMS m/z 263114 43[M-H]-，1HNMR（CD3COCD3，500 MHz） δ： 829（1H，d，J=89 Hz，H4），803（1H，s，H5），797（1H，d，J=95 Hz，H10），772（1H，d，J=95 Hz，H9），724（1H，d，J=90 Hz，H3），713（1H，dd，J=179，114 Hz，H12），582（1H，dd，J=114，20 Hz，H13），539（1H，dd，J=179，20 Hz，H13），255（3H，s，H11），238（3H，s，H14）。化合物7的波譜數據與文獻[10]中報道一致，鑒定為dehydrojuncuenin B

化合物8深黃色粉末（甲醇），1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 863（1H，d，J=75 Hz，H4），788（1H，d，J=75 Hz，H10），756（1H，d，J=80 Hz，H9），723（1H，d，J=80 Hz，H3），717（1H，s，H6），716（1H，s，H8），745（1H，dd，J=145，90 Hz，H12），575（1H，d，J=140 Hz，H13），543（1H，d，J=90 Hz，H13），259（3H，s，CH3），396（3H，s，OCH3）。化合物8的波譜數據與文獻[8]中報道一致，鑒定為2甲氧基7羥基1甲基5乙烯基菲。

化合物9淡黃色粉末（甲醇），HRESIMS m/z 279103 25[M-H]-，1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 808（1H，s，H8），782（1H，s，H6），739（1H，d，J=85 Hz，H4），672（1H，d，J=85 Hz，H3），699（1H，dd，J=175，110 Hz，H12），579（1H，d，J=175 Hz，H13），532（1H，d，J=110 Hz，H13），277（4H，s，H9，10），225（3H，s，CH3）。13CNMR（CD3OD，125 MHz） δ： 1675（COOH），1565（C2），1412（C5α），1396（C1α），1395（C8α），1395（C12），1355（C5），1291（C8），1290（C4），1287（C7），1281（C4α），1255（C6），1220（C1），1142（C12），1122（C3），295（C9），256（C10），119（C11）。化合物9的波譜數據與文獻[9]中報道一致，鑒定為2羥基7羧基1甲基5乙烯基9，10二氫菲。

化合物10淡黃色粉末（甲醇），HRESIMS m/z 277085 68[M-H]-，1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 869（1H，d，J=90 Hz，H4），718（1H，d，J=90 Hz，H3），849（1H，s，H8），819（1H，s，H6），802（1H，d，J=90 Hz，H10），782（1H，d，J=95 Hz，H9），751（1H，dd，J=170，105 Hz，H12），587（1H，d，J=170 Hz，H13），552（1H，d，J=105Hz，H13），260（3H，s，CH3）。化合物10的波譜數據與文獻[13]中報道一致，鑒定為2羥基7羧基1甲基5乙烯基菲。

化合物11深黃色粉末（甲醇）， 1HNMR（DMSOd6，500 MHz） δ： 1300（1H，s，OH5），741（1H，d，J=20 Hz，H6′），740（1H，d，J=20 Hz，H2′），689（1H，d，J=80 Hz，H5′），668（1H，s，H8），645（1H，s，H3），619（1H，s，H6）。化合物11的波譜數據與文獻[14]中報道一致，鑒定為木犀草素。

化合物12白色針狀結晶（甲醇），ESIMS m/z 167[M-H]-；1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 758（1H，s，H6），757（1H，d，J=75 Hz，H2），685（1H，d，J=80 Hz，H5），391（s，3H，OCH3）。化合物12的波譜數據與文獻[15]中報道一致，鑒定為香草酸。

化合物13灰白色結晶（甲醇），ESIMS m/z 177[M-H]-；1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 783（1H，d，J=95 Hz，H4），618（1H，d，J=95 Hz，H3），700（1H，d，J=85 Hz，H5），682（1H，d，J=85 Hz，H6）。13CNMR（CD3OD，125 MHz） δ： 1620（C2），1497（C7），1453（C4），1435（C9），1321（C8），1188（C5），1125（C6），1123（C10），1108（C3）。化合物13的波譜數據與文獻[16]中報道一致，鑒定為瑞香素。

化合物14棕色方塊結晶（甲醇），ESIMS m/z 163[M-H]- ；1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 749（1H，d，J=160 Hz，Hβ），621（1H，d，J=160 Hz，Hα），742（2H，d，J=85 Hz，H2，6），679（2H，d，J=85 Hz，H3，5）。化合物14波譜數據與文獻[17]中報道一致，鑒定為對香豆酸。

4抗焦慮作用評價

41動物分組小鼠隨機分為空白組（05% CMCNa）、陽性對照組（地西泮 05 mg·kg-1）、藥物高（20 mg·kg-1）、中（10 mg·kg-1）、低（5 mg·kg-1）劑量組，每組10只。灌胃給藥，給藥量為001 mL·g-1。

42藥物配制陽性藥配制方法為取10 mg地西泮加入10 mL 05% CMCNa，配制成質量濃度為01 g·L-1的地西泮溶液。

藥物配制方法：配制方法同陽性藥，配制成質量濃度分別為2，1，05 g·L-1的藥物溶液。

43小鼠高架十字迷宮實驗小鼠于給藥30 min后進行高架十字迷宮實驗，將小鼠頭朝向開放臂放入高架十字迷宮的中央平臺中，同時開始計時，記錄小鼠6 min內在高架十字迷宮上的行為。以小鼠進入開放臂的次數（open arm entry，OE）和在開放臂的停留時間（open arm time，OT）為指標，小鼠前后足均進入到臂內為本次進入活動開始，中途任一前足或后足從該臂中完全退出則為該次進入活動結束。

44數據處理計量資料用±s表示，采用統計軟件SPSS 170對數據進行分析，統計方法采用單因素方差分析。

45實驗結果與空白組比較，陽性對照組（地西泮1 mg·kg-1）、juncuenin B低劑量組（5 mg·kg-1）、中劑量組（10 mg·kg-1）、高劑量組（20 mg·kg-1）小鼠進入開放臂次數（OE）和停留時間（OT）均有所增加。其中juncuenin B 低劑量和中劑量對增加小鼠在開放臂停留時間作用較為顯著（P<001），而高劑量組與空白組比較無統計學意義。在增加小鼠進入開放臂次數方面，高、中、低劑量組與空白組相比均無統計學意義。結果表明，juncuenin B 具有抗焦慮作用，其有效劑量為5，10 mg·kg-1。結果見表1。

與空白組比較，陽性對照組（地西泮1 mg·kg-1）、dehydrojuncuenin B低劑量組（5 mg·kg-1）、中劑量組（10 mg·kg-1）、高劑量組（20 mg·kg-1）小鼠進入開放臂次數（OE）和停留時間（OT）均有所增加。但是，對小鼠在開放臂停留時間的影響，只有中劑量組（10 mg·kg-1）和高劑量組（20 mg·kg-1）與空白組比較具有統計學意義（P<005）。Dehydrojuncuenin B高、中、低劑量對小鼠進入開放臂次數的影響與空白組比較均無統計學意義。結果表明，dehydrojuncuenin B具有抗焦慮作用，其有效劑量為10，20 mg·kg-1。結果見表2。

5討論

菲類化合物是燈心草屬植物主要成分，多為中等極性，易溶于醋酸乙酯、乙醇及甲醇等溶劑，主要分布于藥材80%乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位中，因此本實驗針對野燈心草地上部分醋酸乙酯部位進行分離。由于燈心草屬菲類化合物多具有乙烯基，在1HNMR譜圖上有苯環氫和乙烯基氫的特征信號，可利用NMR法對含有菲類化合物的組分進行跟蹤分離。同時，研究發現燈心草主要含有厄弗酚、去氫厄弗酚、燈心草酚及去氫燈心草酚，其中以厄弗酚和去氫厄弗酚含量居多；野燈心草除含有上述4個菲類成分外，還主要含有juncuenin B 和dehydrojuncuenin B，其中dehydrojuncuenin B 含量較大。

本課題組前期已證實厄弗酚、去氫厄弗酚、燈心草酚，2甲氧基7羥基1甲基5乙烯基菲具有較強的抗焦慮活性[78，18]。本實驗證實了juncuenin B和 dehydrojuncuenin B 也具有抗焦慮作用。研究結果顯示，6個菲類化合物抗焦慮作用的劑量略有差別，厄弗酚、去氫厄弗酚和燈心草酚在25 mg·kg-1 劑量下即可產生抗焦慮作用；2甲氧基7羥基1甲基5乙烯基菲、juncuenin B 及dehydrojuncuenin B 在10 mg·kg-1劑量下，均表現出抗焦慮活性。該發現為深入研究燈心草屬植物菲類成分抗焦慮作用的構效關系奠定基礎，為進一步研究和開發燈心草屬植物菲類成分提供了科學依據。

[參考文獻]

[1]吳國芳 中國植物志 第13卷 [M] 北京： 科學出版社，1997：162

[2]江蘇新醫學院編 中藥大辭典[M] 上海：上海科學技術出版社，1977：599

[3]Wang J，Liu J，Wen Q，et al Chemical constituents from the aerial parts of Juncus setchuensis [J] Biochem Syst Ecol，2010，38（5）： 1039

[4]章華偉，倪士峰 野燈心草化學成分的研究 [J] 天然產物研究與開發，2009，21（5）： 7

[5]王小燕 野燈心草化學成分的研究 [D] 沈陽： 沈陽藥科大學，2009

[6]李貴云，王小紅，楊立華，等 基于成分敲除技術辨識燈心草抗焦慮的主要有效成分 [J] 中草藥，2014（6）： 825

[7]Liao Y J，Zhai H F，Zhang B，et al Anxiolytic and sedative effects of dehydroeffusol from Juncus effusus in mice [J] Planta Med，2011，77（5）： 416

[8]Wang Y，Li G Y，Fu Q，et al Two new phenanthrenes from the medullae of Juncus effusus with anxiolytic activity[J] Nat Prod Commun，2014，9（8）：1177

[9]DellaGreca M，Fiorentino A，Mangoni L，et al 9，10dihydrophenanthrene metabolites from Juncus effusus L [J] Tetrahedron，1992，33（36）： 5257

[10]Wang X Y，Ke C Q，Tang C P，et al 9，10Dihydrophenanthrenes and phenanthrenes from Juncus setchuensis [J] J Nat Prod，2009，72（6）： 1209

[11]Katsuhito Shim，Masao Toyota，Yoshinori Asakawa Phenanthrene derivatives from the medullae of Juncus effusus [J] Phytochemistry，1991，30（9）：3149

[12]DellaGreca M，Fiorentino A，Isidori M，et al Phenanthrenoids from the wetland Juncus acutus [J] Phytochemistry，2002，60（6）： 633

[13]王衍龍，張碩峰，李梢，等 燈心草鎮靜作用活性部位的化學成分研究 [C] 廣州：2006第六屆中國藥學會學術年會論，2006

[14]單承鶯，葉永浩，姜洪芳，等 燈心草化學成分研究 [J] 中藥材，2008，31（3）：374

[15]王奇志，紀祝梅，梁敬鈺 梓白皮化學成分研究 [J] 海峽藥學，2003，15（5）：60

[16]張薇，張衛東，李廷釗，等 毛瑞香化學成分研究 [J] 中國中藥雜志，2005，30（7）：513

[17]陳劍，MANGELINCKX Sven，呂寒，等 白子菜醋酸乙酯部位的化學成分研究 [J] 中草藥，2013，44（5）：524

[18]Wang Y G，Wang Y L，Zhai H F，et al Phenanthrenes from Juncus effusus with anxiolytic and sedative activities [J] Nat Prod Res，2012，26（13）：1234

[責任編輯丁廣治]