丹酚酸組分中7種酚酸類成分對缺氧損傷的人臍靜脈內皮細胞保護作用的研究お

韓秀娟 劉丹 封亮?├畛? 賈曉斌 董自波

[摘要]該文采用連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）體外誘導人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）缺氧損傷模型，以丹酚酸組分對HUVEC缺氧損傷的保護作用為切入點，采用MTT比色法測定細胞活力，試劑盒測定細胞超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、乳酸脫氫酶（LDH）含量、一氧化氮（NO）含量及白細胞介素6 （IL6）和腫瘤壞死因子α（TNFα）的表達，探討7種丹參酚酸類成分在丹酚酸組分對Na2S2O4誘導的HUVEC缺氧損傷模型的保護作用中發揮的作用。在組分結構理論指導下，研究丹酚酸組分中主要化學成分在丹酚酸抗缺氧損傷藥效發揮過程中的貢獻度，結果顯示，丹酚酸B，迷迭香酸，丹酚酸A，丹參素，紫草酸5種成分在丹酚酸組分抗缺氧損傷作用中的貢獻度較大，對這5種成分分別進行組合給藥，初步得到丹酚酸B，迷迭香酸，丹酚酸A，丹參素4種成分組合能夠作為丹酚酸組分的代表性成分。

[關鍵詞]丹酚酸組分；缺氧損傷；貢獻度

中藥是一個多成分的復雜體系，是化合物豐富的寶庫。組分結構理論認為，中藥物質基礎是由多成分構成的，且多種成分并不是簡單的堆積，而是一個有序的整體，單體成分是最基本的單位，相似的單體成分按照一定的比例構成了組分，不同的組分又按照一定的比例構成了中藥的整體[1]。中藥發揮藥效強調整體性，各個成分對中藥整體藥效存在不同貢獻作用。本研究借助Na2S2O4體外誘導HUVEC細胞缺氧損傷模型[2]，研究丹酚酸組分中7種酚酸類成分在丹酚酸組分發揮抗缺氧損傷藥效的貢獻度，以期為科學評價丹酚酸組分提供一些依據。

丹參為鼠尾草屬植物丹參Salviae miltiorrhiza的干燥根或根莖，具有活血調經、祛淤止痛、涼血消癰、清心除煩等功效[3]。丹酚酸組分為丹參的水溶性酚酸成分，主要有丹酚酸A（salvianolic acid A）、咖啡酸（caffeic acid）、丹酚酸B（salvianolic acid B）、迷迭香酸（posrnarinic acid）、紫草酸（lithospermic acid）、原兒茶醛（protocatechualdehyde ）、丹參素（lactic acid）等[4]，具有抗脂質過氧化、消除自由基、保護線粒體、調節能量代謝、抗心肌缺血等生物活性，是治療心血管疾病的主要藥效物質[56]。

本研究采用化學試劑Na2S2O4誘導建立HUVEC缺氧模型，借此模擬心肌缺血缺氧微環境，MTT法研究了丹酚酸組分、7種丹參酚酸成分對Na2S2O4誘導的HUVEC缺氧損傷的保護作用，以細胞存活率為指標[7]，對其抗缺氧活性進行客觀地量化評價，計算各成分在丹酚酸組分抗缺氧效果中所占的貢獻度，從而找出丹酚酸組分中抗缺氧主要的藥效物質，以期為科學評價丹酚酸組分提供依據。

1材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀（包括四元泵，自動進樣器，DAD二極管陣列檢測器）；METTLERAL204天平 （1/10萬，梅特勒托利多儀器有限公司）；HH4數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；二氧化碳培養箱（Thermo Electrom公司）；生物安全柜（Labconco Purifier Class Ⅱ Biosafety Cabinet）；LDZK50KB立式壓力蒸氣滅菌器（安海申安醫療器械廠）；低速大容量多管離心機（Anke TDL40B型，上海安亭科學儀器廠產品）；微量移液器（Thermo，美國）；高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；MilliQ純水機（美國Millipore公司）；全自動酶標儀（Thermo Electrom公司）；細胞計數器[XBK25（1/400 mm2）]。

丹酚酸組分（西安鴻生生物技術有限公司，批號140714）；連二亞硫酸鈉（美國Sigma公司）；丹參素鈉，迷迭香酸，紫草酸，原兒茶醛，咖啡酸，丹酚酸A，丹酚酸B對照品均購自成都曼斯特生物制品有限公司，批號分別為14030108，14020115，14052702，14021902，14030510，14072511，14052113。

DMEM低糖不完全培養基（南京凱基生物發展公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，南京化學試劑有限公司）；MTT（美國Sigma公司）；白細胞介素6（IL6）含量測定試劑盒，腫瘤壞死因子α（TNFα）ELISA測定試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC） 購自南京凱基生物發展公司。

2方法與結果

21色譜條件Hedera ODS2色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） 15%甲酸（B），梯度程序洗脫（0～6 min，5%～13%A；6～13 min，13%～15%A；13～25 min，15%～18%A；25～34 min，18%～21%A；34～50 min，21%～25%A；50～60 min，25%～62%A）；流速10 mL·min-1；檢測波長286 nm；進樣量10 μL。樣品和對照品均可實現基線分離，測定均無干擾（圖1）。

22對照品溶液制備及方法學考察分別精密稱取丹參素鈉對照品091 mg，原兒茶醛對照品129 mg，咖啡酸對照品080 mg，迷迭香酸對照品090 mg，紫草酸對照品096 mg，丹酚酸B對照品166 mg，丹酚酸A對照品142 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得質量濃度為9100，12900，8000，9000，9600，16600，14200 mg·L-1的對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液05，10，25，40，50，75 mL至10 mL量瓶中，用甲醇

稀釋并定容，搖勻，用045 μm微孔濾膜過濾，取濾液，進行HPLC測定其對應的峰面積，以濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程（表1）。

精密度試驗：精密吸取7種成分的對照品溶液進行精密度考察。按色譜條件連續5次進樣，計算丹參素，原兒茶醛，咖啡酸，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A峰面積的RSD分別為093%，056%，034%，065%，095%，088%，10%，表明儀器的精密度良好。

重復性試驗：精密稱取丹酚酸組分樣品平行制備6份供試品，連續進樣，測定丹參素，原兒茶醛，咖啡酸，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A含量的RSD分別為11%，15%，11%，16%，13%，19%，17%，表明重復性均良好。

穩定性試驗：取丹酚酸組分樣品，分別在0，2，4，8，12，24 h時HPLC測定峰面積，計算各成分的含量，丹參素，原兒茶醛，咖啡酸，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A含量的RSD分別為11%，20%，15%，17%，12%，12%，17%，說明供試品溶液在24 h內各成分穩定性較好。

加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的丹酚酸組分樣品，制備成供試品溶液6份，吸取10 mL，置10 mL量瓶中，分別精密加入丹酚酸B對照品，蒸餾水定容至刻度，計算丹酚酸B的平均加樣回收率為9849%。

23統計學處理實驗過程中所產生數據均采用SPSS 160 進行處理，各組間數據比較采用t檢驗，用±s表示，P<005為有統計學意義。

24MTT法篩選Na2S2O4的造模濃度以及藥物給藥濃度取對數生長期的HUVEC，將其消化后調整細胞密度為1×105個/mL，均勻接種于96孔板上，置于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養24 h，吸棄培養基，分別進行篩選試驗：①分別加入含終濃度為01，02，05，10，15，20，50，100 mmoL·L-1 Na2S2O4的不完全DMEM低糖培養基100 μL；②分別加入含終濃度為 1×10-3，8×10-4，5×10-4，2×10-4，1×10-4，5×10-5，1×10-5 g·mL-1丹酚酸組分的不完全DMEM低糖培養基100 μL，每個濃度均設6個復孔，置于37℃，5%CO2條件的培養箱中作用24 h后，吸棄上層培養基，每孔加入500 mg·L-1 MTT 100 μL，在培養箱中培養4 h后，吸棄孔內培養基，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），37 ℃恒溫振蕩10 min，全自動酶標儀測定各孔吸光度（A）。

細胞存活率=（A細胞給藥組-A空白給藥組）/（A細胞空白組-A空白組）×100%

根據MTT實驗結果，確定后繼實驗中Na2S2O4以及藥物的給藥濃度。當細胞存活率大于95%時可認為藥物對細胞無毒性。結果表明，丹酚酸組分質量濃度為1×10-5，5×10-5，1×10-4，2×10-4，5×10-4 g·mL-1時，細胞存活率均在95%以上，當丹酚酸組分質量濃度增加至8×10-4 g·mL-1時，細胞存活率開始下降（表2）。綜合分析，選用5×10-4 g·mL-1作為后續實驗中的給藥濃度。

當Na2S2O4濃度為01，02 mmol·L-1時，對細胞凋亡作用不明顯。隨著Na2S2O4濃度的增加，細胞損傷明顯，存活率呈明顯下降趨勢。當Na2S2O4濃度為20 mmol·L-1時，細胞存活率為4875%，此時細胞損傷適中（圖2），故選擇20 mmol·L-1的Na2S2O4作為造模濃度。

25丹酚酸組分及7種酚酸類成分對缺氧損傷的HUVEC存活率的影響實驗分為10組，分別為空白對照組、模型組（Na2S2O4組）、丹酚酸組分組、丹參素組、原兒茶醛組、咖啡酸組、迷迭香酸組、紫草酸組、丹酚酸B組、丹酚酸A組，其中各單體組中成分含量相當于丹酚酸組分中各種成分的含量。取對數生長期的細胞，將其消化后調整細胞密度接種于96孔板中，于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養24 h后，除空白對照孔外每孔均加入終濃度為2 mmol·L-1的Na2S2O4不完全培養基，于37 ℃，5% CO2的培養箱中作用24 h后吸棄培養基，給藥組進行細胞給藥，于37 ℃，5% CO2的培養箱孵育24 h，MTT法檢測細胞活性。

根據7種丹參酚酸化學成分及丹酚酸組分對缺氧損傷的HUVEC存活率的影響，計算各成分對缺氧損傷HUVEC的保護作用，以模型組及丹酚酸組分組對HUVEC的存活率為標準，計算各成分對丹酚酸組分整體抗缺氧損傷的貢獻度C。

C=Ix/Iw×100%（1）

Iw為丹酚酸組分對缺氧損傷HUVEC的保護作用；Ix為各化學成分（濃度相當于丹酚酸組分中的含量濃度）對缺氧損傷HUVEC的保護作用。

I=給藥組細胞存活率-模型組細胞存活率

根據以上公式，計算丹酚酸組分中7種酚酸成分對缺氧損傷HUVEC保護作用的貢獻度。丹酚酸組分中各成分對缺氧損傷的HUVEC均具有一定的保護作用（圖3）。

根據7種丹酚酸類成分對缺氧損傷的HUVEC存活率的影響，計算各樣品對缺氧損傷的HUVEC細胞的保護作用（表3）。

26丹酚酸組分不同成分組合對缺氧損傷HUVEC細胞的影響對7種丹參酚酸成分對缺氧損傷的HUVEC保護作用的貢獻度大小進行排序，選擇貢獻度較大成分進行組合給藥。實驗分為8組，空白對照組、模型組（Na2S2O4組）、丹酚酸組分組、丹酚酸B組、丹酚酸B+迷迭香酸組、丹酚酸B+迷迭香酸+

丹酚酸A組、丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素組、丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素+紫草酸組，其中各單體組合組中成分含量相當于丹酚酸組分中各種成分的含量。取對數生長期的細胞，將其消化后接種于6孔板中，種板及給藥步驟同24項。細胞給藥后于37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h，吸棄培養基，每孔加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下15 000 r·min-1離心3 min，收集上清，進行試劑盒相關指標測定。

正常機體內存在一定活性的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）等構成的天然抗氧化系統，SOD是清除過量氧自由基系統中的抗氧化酶之一，其活性能夠反映機體抗氧化能力。丙二醛（MDA）是機體脂質過氧化的產物之一，間接反映機體組織自由基含量[8]。乳酸脫氫酶（LDH）是胞內酶，其漏出量的多少可反映細胞膜的受損程度[9]。一氧化氮（NO）可促進血管舒張，減少血栓的形成，但高濃度的NO 則會誘發細胞毒性，增加血管通透性，進而導致血管壁損害[10]。結果顯示，經Na2S2O4刺激后的細胞，模型組SOD的活性顯著降低（P<001），MDA，LDH和NO顯著升高，與空白對照組相比，均具有顯著差異（P<001）。與模型組相比，經藥物處理后，各給藥組均能降低LDH，MDA，NO含量，同時提高SOD的活性，且具有統計學意義（P<005或P<001），表明丹酚酸組分及其各成分組合可抑制Na2S2O4誘導的細胞缺氧損傷，對內皮細胞具有一定的保護作用。與丹酚酸組分相比，丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素+紫草酸組和丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素組改善SOD，MDA，LDH和NO釋放作用，無顯著差異（表4）。

白細胞介素6 （IL6）是機體免疫、內分泌調節的主要分子，與炎癥調節和免疫反應有關。腫瘤壞死因子α（TNFα）是由被激活的單核細胞、巨噬細胞分泌的一種可溶性多肽類細胞因子。TNFα可刺激內皮細胞產生血小板激活因子，還對血管內皮細胞產生直接細胞毒副作用，破壞其結構和功能的完整性，促進炎性介質分泌，參與血管平滑肌細胞的增殖、分化和調控，使血管壁增厚，管腔狹窄[11]。結果顯示，與空白組對比，細胞經缺氧造模后，炎癥因子TNFα， IL6的表達顯著增高（P<001）；與模型組相比，經藥物處理后，各給藥組均能降低TNFα， IL6的表達，具有統計學意義（P<005或P<001），表明丹酚酸組分及其各成分組合均對內皮細胞具有一定的保護作用；與丹酚酸組分相比，丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素+紫草酸組和丹酚酸B+迷迭香酸+丹酚酸A+丹參素組改善TNFα，IL6的表達，無顯著差異（表5）。

3討論

中藥組分中成分較為復雜，不同成分之間的含量和生物活性存在著明顯的差異。在進行中藥組分的評價研究時不可能兼顧到每個化學成分，但也不能盲目地挑選某個指標成分代表組分整體[12]。因此，如何科學、合理的從組分的眾多成分中篩選出具有代表性且貢獻度較大的成分，使其整體性質能夠體現組分的特性，進而體現中藥（復方）的整體特性，是現代中藥研究的重點[1314]。本研究在考慮組分內各成分含量和生物活性的前提下，對組分內有限個成分進行配伍配比后，選擇藥理作用與組分整體的藥理作用無統計學差異的成分組合，那么這些成分的綜合性質就可以表征該組分整體的性質。

丹參是治療心腦血管疾病的良藥，水溶性丹酚酸類成分是丹參主要藥效物質基礎[15]，丹酚酸類成分具有不同程度的抗氧自由基、抗炎和抗細胞內鈣超負荷作用。本研究針對丹酚酸組分中7種酚酸成分抗HUVEC細胞缺氧損傷作用進行研究，借助Na2S2O4誘導內皮細胞的缺氧損傷，導致細胞產生脂質過氧化反應，使血管內皮功能出現紊亂。血管內皮細胞功能是導致心血管疾病的發生和發展的關鍵因素，內皮細胞處于缺氧狀態可導致大量活性氧的產生。通過MTT 實驗篩選出最合適的造模濃度，模擬心肌缺血缺氧微環境，進一步考察丹酚酸組分中不同成分對缺氧損傷人臍靜脈內皮細胞的保護作用。在各成分組合給藥與組分整體的作用結果比較中，單個成分或2個成分組合的藥理作用明顯不如組分整體的藥理作用。由此可見，目前文獻和藥典中單指標成分對組分進行質量控制并不科學。基于用藥方便、質量可控原則，結合本研究實驗結果貢獻度分析，代表丹酚酸組分整體性質的有限個代表性成分為丹酚酸B、迷迭香酸、丹酚酸A、丹參素。這將為如何構建丹酚酸組分生物藥劑學評價提供基礎。

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[責任編輯馬超一]