茵梔黃注射液抗膽汁淤積藥效成分的篩選及其作用機制研究お

譚楨 劉愛明 羅敏 郭賓

[摘要]篩選茵梔黃注射液中的主要藥效成分，評價其調節膽汁酸代謝相關基因，發揮護肝作用的機制。選用雄性健康ICR小鼠30只，分為6組：正常對照組、模型對照組、綠原酸組、梔子苷組、黃芩苷組、濱蒿內酯組。檢測肝功能、肝組織病理學變化以及膽汁酸代謝相關基因的表達。綠原酸組小鼠血清ALT，AST，ALP，TBA水平分別為（1589±253），（1832±256），（2638±987） U·L-1，（4063±767） μmol·L-1，梔子苷組小鼠分別為（2054±236），（2428±519），（3509±503）U·L-1，（4286±711） μmol·L-1，均低于模型對照組（5952±1094），（12837±1797），（16952±962） U·L-1，（13250±3300） μmol·L-1。肝組織病理學分析顯示，綠原酸組、梔子苷組小鼠肝細胞的壞死、炎性細胞浸潤程度與模型對照組比較均顯著減輕。熒光定量QPCR檢測顯示，給予綠原酸、梔子苷治療后，膽汁酸代謝相關基因mRNA的變化較模型對照組均發生了代償性的逆轉。茵梔黃注射液中的綠原酸和梔子苷能有效改善膽汁淤積、肝功能及肝臟病理性損傷，并逆轉ANIT引起的膽汁酸代謝相關基因mRNA變化，從而起到肝保護作用。

[關鍵詞]茵梔黃注射液；綠原酸；梔子苷；膽汁酸代謝；肝內膽汁淤積

茵梔黃注射液由茵陳、梔子、金銀花、黃芩等4 味中藥組成，具有清熱、解毒、利濕、退黃疸和降低轉氨酶的作用[14]，臨床廣泛用于治療膽汁淤積。茵梔黃注射液作為復方制劑，由于其配伍成分組成復雜，其具體藥效成分及藥理學機制尚不清楚。前期，本課題組采用LCMSITTOF分析技術，歸屬推導了24種成分，初步鑒定了茵梔黃注射液中的化學成分黃芩苷、綠原酸、梔子苷、黃芩素、漢黃芩苷、梔子酸、新綠原酸、咖啡酸、濱蒿內酯等[56]。其中，黃芩苷、綠原酸、梔子苷是含量較多的組分， 本研究將對這幾種主要成分的藥效活性進行篩選。

近年來，隨著分子生物學的發展，對膽汁淤積疾病的分子生物學相關機制的研究也進一步深入。現已研究證實，分布于肝細胞膜血管側膜轉運體 Na+牛磺膽酸共轉運多肽（Ntcp）、有機陰離子轉運多肽2（Oatp2）及膽管側膜轉運體多藥耐藥相關蛋白2（Mrp2）、膽鹽輸出泵（Bsep）對膽酸鹽及膽紅素的轉運具有重要作用[79]。因此，對膽汁酸代謝相關酶及轉運體的研究成為治療膽汁淤積的新方向。

綠原酸是茵陳的主要成分，有促進膽汁分泌和清熱解毒等功效。研究發現，綠原酸對CCl4引起的肝毒性有明顯的保護作用[10]。梔子苷作為梔子的主要成分，對酒精引起的急性肝損傷有一定保護作用[11]。研究報道黃芩苷固體分散體對小鼠D氨基半乳糖急性肝損傷有一定保護作用[12]。濱蒿內酯作為茵梔黃中的成分之一，能夠通過激動CAR受體提高膽紅素清除率[13]。本實驗通過ANIT誘導肝內膽汁淤積小鼠動物模型，研究茵梔黃中的主要成分綠原酸、梔子苷、黃芩苷、濱蒿內酯等對ANIT誘導膽汁淤積的治療作用以及對膽汁酸代謝相關轉運體表達的影響，以期從分子水平探討茵梔黃中主要成分的作用機制及靶點，為基于傳統中藥天然活性成分的發展提供理論基礎。

1材料

α異硫氰酸萘酯（ANIT，Sigma公司）；綠原酸、梔子苷、黃芩苷、濱蒿內酯（中國食品藥品檢定研究院）；定量PCR試劑（SYBR Green PCR Master Mix，Roche公司）；定量PCR儀（LightCycle 480，Roche公司）；肝功能有關試劑盒（長沙永和陽光科技有限公司）。

雄性健康小鼠30只，體重（20±5）g，寧波大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK20130191。所有動物飼養于寧波大學實驗動物房，室溫恒定，經過適應性喂養，飲食、飲水正常者，無不良反應，即納入實驗。

2方法

21動物實驗

雄性小鼠30只，隨機分為正常對照組、模型對照組、綠原酸組、梔子苷組、黃芩苷組、濱蒿內酯組，每組各5只。綠原酸組、梔子苷組、黃芩苷組、濱蒿內酯組分別灌胃綠原酸、梔子苷、黃芩苷、濱蒿內酯（50 mg·kg-1·d-1，其中，綠原酸、黃芩苷、濱蒿內酯溶解于玉米油中，梔子苷溶解于生理鹽水中），共計5 d。第4天，模型對照組、綠原酸組、梔子苷組、黃芩苷組、濱蒿內酯組分別采用ANIT灌胃1次（75 mg·kg-1），誘發小鼠急性肝內膽汁淤積病變。同時各組繼續分別灌胃綠原酸、梔子苷、黃芩苷、濱蒿內酯，共計5 d，ANIT灌胃48 h后所有小鼠處死。

22標本采集及保存

小鼠于眼眶采血后，15 mL離心管收集血液，并脫頸處死。將其固定在手術臺上，剪去腹部鼠毛，將腹部皮膚及皮下組織一并剪開，充分暴露肝臟，取新鮮肝組織，其中肝左葉至于10%中性福爾馬林緩沖溶液中固定，后期進行病理學檢查，其余部分標記后迅速置于放入干冰中速凍保存，后轉入-80 ℃冰箱長期保存。

23血清生化指標檢測

小鼠血液于2 000 r·min-1 離心5 min后取血清，生化分析儀測定血清中 AST（谷草轉氨酶）、ALT（谷丙轉氨酶）、ALP（堿性磷酸酶）、TBA（總膽汁酸）。

24肝臟病理切片

小鼠肝臟10%中性福爾馬林緩沖溶液固定24 h后，脫水，石蠟包埋。常規切片，HE染色，顯微鏡觀察肝臟病理形態學變化。

25膽汁酸代謝相關基因mRNA表達水平測定

251RNA提取肝臟組織中加入Triol，勻漿，分層，濃縮，沉淀，洗滌，溶解，提取總RNA，Nano Drop 2000測定吸光度A值，做總RNA的純度檢測。

252逆轉錄反應取1 μg總RNA，加入MMLV逆轉錄試劑，普通PCR儀中反應合成模板DNA，于-20 ℃保存備用。

253熒光定量RTPCR測定模板cDNA 1 μL，Master Mix 5 μL，上游引物02 μL，下游引物02 μL，DEPC水36 μL，組成10 μL的體系，熒光定量PCR儀中變性、退火、延伸。反應結束后，熒光定量PCR儀自動分析并計算結果。其中， 實驗中所設計的引物序列見表1， 所有的引物序列均來源于引物數據庫（http：//mouseprimerdepotncinihgov/）。

26數據統計

采用SPSS 120軟件、Microsoft Excel 2003和Sigma Plot 110對生化分析結果及QPCR測定膽汁酸代謝相關基因結果進行分析，P<005表明各組數據存在差異，結果具有統計學意義。

3結果

31小鼠血清肝功能檢測

與正常對照組相比，陽性對照組ALT和AST明顯升高（P<0001），顯示其存在肝細胞損傷，同時，ALP和TBA也顯著增加（P<0001）。而與陽性對照組比較，綠原酸組與梔子苷組ALT，AST，ALP和TBA降低，黃芩苷組和濱蒿內酯組的ALP，ALT，AST與陽性對照組之間無明顯差異，提示綠原酸和梔子苷能在一定程度上抑制ANIT誘導的肝毒性，對肝內膽汁淤積有明顯的肝保護作用，而黃芩苷和濱蒿內酯血生化分析結果顯示沒有明顯的保護作用，見圖1。

32肝臟組織病理學變化

正常組，肝臟外觀輪廓、顏色正常；肝組織病理觀察，肝小葉結構清晰、肝細胞核大而圓，核膜清晰，胞漿豐富、淡染，見圖2A。ANIT組（模型組），肝臟外觀明顯腫脹，有大片狀灰白色出現；肝組織病理觀察，有大面積病灶可見，肝小葉輪廓不清，大量炎細胞浸潤，壞死明顯，見圖2B。黃芩苷組和濱蒿內酯組，仍有大面積病灶可見，病變癥狀未得到減輕，無明顯肝保護作用，見圖2C，2D。綠原酸及梔子苷組，中央靜脈及肝竇輕度充血，點、灶狀壞死散在分布，少許炎細胞浸潤，壞死病灶明顯減少，見圖2E，2F，2G，2H。

33膽汁酸合成相關基因表達的影響

本實驗中以熒光定量QPCR檢測正常對照組、模型對照組、綠原酸組和梔子苷組小鼠肝臟組織膽汁酸合成相關基因mRNA的表達差異。模型對照組小鼠肝臟膽汁酸合成相關酶Cyp7a1，Cyp8b1 mRNA表達與正常對照組相比均顯著降低，綠原酸和梔子苷組中膽汁酸合成酶的mRNA較模型對照組表達被逆轉至正常水平，見圖3。提示綠原酸和梔子苷可能通過改善ANIT誘導的膽汁酸合成酶mRNA的變化從而發揮肝保護作用。

34膽汁酸轉運相關基因表達的影響

肝膽細胞膜相關轉運蛋白有機陰離子轉運多肽（Oatp）和鈉離子牛磺膽酸協同轉運多肽（NTCP）的mRNA在模型對照組、綠原酸組和梔子苷組中相比于正常對照組均表達升高，模型對照組中，多藥耐藥

相關蛋白Mrp2，Mrp3，Mrp4和鈉依賴性膽鹽轉運體Ostb的mRNA表達較正常對照組升高，給予綠原酸、梔子苷治療后，均出現降低，見圖4。說明綠原酸和梔子苷對Mrp2，Mrp3，Mrp4以及Ostb mRNA表達水平的逆轉作用可能是繼發于ANIT的毒性反應，從而發揮肝保護作用。綜上可知，膽汁酸體內代謝是一個復雜的過程，包括膽汁酸的合成、重攝取及排泄過程，本實驗中膽汁酸代謝過程中相關轉運體的變化情況見圖5，說明綠原酸與梔子苷在一定程度上抑制了ANIT對轉運體的改變，從而抑制ANIT所誘導的肝毒性，起到肝臟保護作用。

4討論

ANIT是一種化學物質，自1952年一位美國專家首次用它復制出肝內膽汁淤積模型以來，被廣泛應用于肝內膽汁淤積模型的復制。ANIT作為一種間接肝毒劑，主要損害肝內膽管上皮細胞，引起肝

內膽管增生及小葉間膽管周圍炎癥，從而造成膽管阻塞，形成明顯的膽汁淤積，并伴有以點狀壞死為主的肝實質細胞損害，產生膽汁淤積性黃疸，出現高膽紅素血癥和膽汁分泌降低。同時還引起膜脂質過氧化反應，致使肝細胞變性壞死，胞內ALT大量溢入血流。該模型復制簡單易行，重復性好，是篩選和研究保肝藥物及利膽藥的理想實驗動物模型[14]。

膽汁酸的代謝包括膽汁酸合成、轉運和排泄。膽汁酸的原料為膽固醇，經過一系列的酶促反應，形成膽汁酸。膽汁酸有2種合成途徑[15]，經典途徑

是膽汁酸合成的主要途徑，經典途徑由膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7αhydroxylase，CYP7A1）啟動，CYP7A1是此反應的限速酶。膽汁酸合成的另一個途徑稱為替代途徑，由甾醇27α羥化酶（CYP27A1）和甾醇12α羥化酶（CYP7B1）啟動，最終生成鵝脫氧膽酸。研究報道稱ANIT干預后會誘導SHP mRNA表達的增加，SHP與LRH1形成的二聚體會抑制Cyp7α1，Cyp8b1的表達[1618]。本研究中，ANIT誘導肝內膽汁淤積后，膽汁酸合成酶相關基因表達均降低，給予綠原酸和梔子苷治療后表達恢復到正常水平。同樣，ANIT誘導后，膽汁酸重攝取轉運體Oatps和Ntcp mRNA表達降低，綠原酸和梔子苷治療后恢復正常。Chisholm的研究指出HNF1α在調節重攝取轉運體中發揮了重要作用，ANIT降低HNF1α以及轉運體Oatps和Ntcp的mRNA表達[19]。以上研究說明，綠原酸和梔子苷可以從一定程度上代償性逆轉ANIT所引起的膽汁酸合成酶的降低。

在ANIT所誘導的膽汁淤積模型中，有研究發現大黃素對ANIT所引起的膽汁淤積型肝炎有好的保護作用，其中，大黃素主要通過抑制促炎因子、氧化應激損傷等發揮作用[20]。中藥制劑丹寧片也能通過改善氧化應激以及抑制中性粒細胞浸潤等途徑起到肝保護作用[21]。在脂多糖（LPS）誘導的C56/BL6小鼠急性肝損傷模型中，給藥50 mg·kg-1綠原酸后，肝臟顏色由黃色恢復為正常的淡紅色，ALT，AST水平顯著降低，且通過預先給藥綠原酸，TLR4，TNFα，NFκB等炎癥基因mRNA表達水平有所降低，提示綠原酸可能通過抗炎機制對LPS誘導的肝毒性起到保護作用[22]。在梔子苷保護酒精性肝損傷的研究中，抗氧化酶GSH，GST，GPx，CuZnSOD和CAT的活性上調，氧化應激肝損傷明顯改善[11]。本研究中，病理學分析顯示模型對照組中小鼠肝臟有大面積病灶可見，肝小葉輪廓不清，大量炎細胞浸潤，綠原酸和梔子苷組中炎性細胞浸潤明顯減少。因此，綠原酸和梔子苷是否通過抑制炎癥通路從而實現對ANIT誘導的膽汁淤積和急性肝損傷起到肝臟保護作用，有必要對其機制進行更加深入的了解，為天然藥物的臨床應用提供科學合理的理論依據。

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[責任編輯曹陽陽]