關于無菌制劑無菌檢查方法驗證的探討

王瑩

摘 要：在現代質量體系驗證的過程中，關于檢驗方法的驗證十分重要，這對于質量控制的相關技術以及方法，包括手段是否具有科學性都產生了直接的影響，因此是質檢體系中最為重要的組成部分，我國在相關規定中也指出，加強對無菌制劑的檢驗工作，應該采取科學合理的檢驗方法，并且如果出現檢驗條件出現改變時，那么也應該進行重新檢驗，以保證檢驗結果的準確性。本文重點對無菌制劑的檢查方法進行介紹，并驗證結果，希望對今后的工作有所幫助，可以進一步提升檢驗質量。

關鍵詞：方法驗證；無菌制劑；無菌檢查

在檢查藥典中，無菌制劑都需要采用無菌檢查法對其質量進行檢驗，觀察是否真正呈現出無菌的狀態，只有通過無菌檢驗后，才能保證無菌產品的出售。同時這也是無菌產品質量檢驗過程中一個重要組成部分。在微生物生長過程中，判斷樣品是否受到污染，就需要依靠無菌檢查法才能實現。受到各種因素的影響，檢驗量、培養基質量以及無菌技術等都會在一定程度上影響著無菌檢查的質量，因此需要我們更加深入的對其進行研究，以實現更加科學化與高質量的檢驗。

1 影響無菌檢查結果的主要因素

首先，供試品的組分會對無菌檢查結果產生一定的影響。受到供試品自身特點的影響，其內部極有可能含有抑制成分，如黃連就是典型的抑制成分，又或者含防腐劑以及輔料等，都會在一定程度上對微生物產生抑制的作用，對微生物造成不同程度的污染，這樣一來，無菌檢查的結果就會失去準確性，產生不同程度的損傷也是無法避免的。此外，受到不同原料產地的影響，加之生產工藝也不可能完全一致，尤其是在對中藥制劑進行生產的過程中，即使是同一廠家生產的藥品，在不同批次中微生物的生長還會具有差異性。所以說，這些因素都會對無菌檢查結果帶來不同的影響。其次，微生物自身就具有多樣性與復雜性的特點。在自然界中，微生物都是以不同形態或者在不同的環境中生存下來的，所以在生長過程中所受到的污染也有可能具有差異性的特點。當同樣的產品放在不同的生產區域中時，微生物受到污染的形態也極有可能不同，因此，運用同樣一種檢查方法并不能完全保證準確的檢驗出結果，從公平性上也是不公平的。所以在對無菌制劑進行檢驗的過程中，應該充分考慮到微生物自身所具有的特點，再選取合適的檢查方式進行檢驗，這樣才可以保證檢驗結果的準確性。第三，在對無菌制劑中的微生物進行檢驗的過程中，檢查方法是相當重要的。其中包含以下幾個方面的內容，一是供試液的制備方法，二是微生物的檢測方法，只有選擇了適宜的檢查方法，才能有效的實現檢驗結果的準確性。在對微生物進行檢驗時，應該先進行供試液的制備，供試品具有不同的特性，所以制備的方式也不盡相同。因此在這一過程中多少會對微生物的生長產生一定的影響，如果運用同樣的供試液檢驗微生物，那么結果可能也會有所差異，并且供試液的濃度會直接對供試品產生抑制性的作用，這些都是需要考慮的因素。第四，在檢驗條件方面，微生物之所以會在檢驗過程中受到污染，與檢驗條件這一因素具有密不可分的關系。因為微生物在培養基中生長的過程中，檢驗的目的就是要對微生物是否受到污染進行判斷，所以檢驗條件是直接的影響因素，例如培養時間的不同，亦或是培養基的質量具有差異性，都會對檢驗結果產生直接的影響，造成誤差的出現。另外，受到外界因素的影響，如檢驗人員的手段不嫻熟，因為其失誤造成的問題，也都會影響到檢驗結果的真實可靠性。

2 對無菌制劑中微生物檢驗方法的要求

首先，對驗證的類型具有一定的要求。驗證類型可以分為以下幾個部分。如前驗證，前驗證是在建立藥品無菌的檢驗方法時進行的驗證；再驗證，這主要是在對無菌檢驗方法進行修訂時進行而展開的驗證；另外還包括定期方法驗證，主要是當供試品的組分出現改變時，如果對檢驗結果產生一定的影響，那么就需要進行定期方法驗證。其次，對于驗證的主要內容而言，主要是用于對抑制細菌、抑制真菌而進行的驗證試驗，另外，在對供試品進行處理時，也需要進行驗證試驗，上述驗證試驗中所采用的方法以及環境等是否符合驗證的要求也需要經過無菌檢查后才能判定。第三，還應該對驗證試驗中所產生的關鍵性因素進行考量。試驗菌中主要包含了對試驗菌種類的選擇，對菌種的具體要求以及對試驗菌液進行制備，這些都是需要考慮的因素，如果想要令實驗結果更加準確與公正，就要保證嚴格按照上述的要求進行驗證，這樣才可以有效的避免出現問題。

3 驗證方法

3.1 菌種選擇

無菌檢查法的驗證試驗選擇了以下6株菌：金黃色葡萄萄球菌，代表革蘭陰性菌；銅綠假單胞菌或大腸埃希菌（用于抗革蘭陰性菌為主的供試品）代表革蘭陰性菌；生孢梭菌代表厭氧菌；白色念珠菌代表酵母菌；黑曲霉代表霉菌；枯草芽孢桿菌是代表藥品中常見的污染菌-芽孢桿菌。選擇的菌株都是微生物試驗中常用的控制菌，且為標準菌株。每一試驗菌均應進行驗證試驗，根據各菌株所代表的微生物種類進行驗證試驗，如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌代表好氧細菌和厭氧菌，培養基采用硫乙醇酸鹽流體培養基；而白色念珠菌和黑曲霉代表真菌，培養基采用改良馬丁培養基。

3.2 菌種要求

無菌檢查方法驗證試驗所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），以保證試驗菌株的生物特性。

3.3 菌液制備

取經30℃～45℃培養18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌營養肉湯培養物、取經35℃培養18～24h的生孢梭菌流體硫乙醇酸鹽液體培養物、取經23℃～28℃培養24～48h的白色念珠菌改良馬丁液體培養物、取經23℃～28℃培養1周的黑曲霉斜面培養物，加3～5mL0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液分別稀釋，制成約含菌10～100cfu/mL。

3.4 供試品的取樣和處理

無菌產品中個成分的含量應該是均勻的，因此只要確定在驗證的方法中，按所需的總接種量即可，而不必強求按規定的容器數取樣。如果供試品需要溶解、稀釋、乳化等處理，則必須確認這些處理對微生物無影響。

3.5 驗證實驗

薄膜過濾法的驗證。分別做供試品組及對照組，與對照組比較供試品組微生物的生長情況。沖洗次數及沖洗體積同時要在驗證試驗中得到確認。直接接種法的驗證。分別做供試品組及對照組，與對照組比較供試品組微生物的生長情況。結果判斷與薄膜過濾法的驗證相同。

4 需要注意的問題

培養基的適用性檢查包括培養基的無菌性檢查和培養基的靈敏度檢查，驗證試驗的培養基適用性檢查必須符合要求。菌株選擇的原則為具有代表性、普遍性、易存活、在該制劑中常見的污染菌。為安全起見，試驗菌株應選擇同類菌種中的低或非致病性的標準菌株；另外，試驗菌株宜選擇生物活性比較穩定的菌株，有利于實驗結果的重現。實驗室菌種的處理和保藏的程序應標準化，盡可能減少菌種污染和避免生長特性的改變。驗證試驗用的菌懸液并不是只要活的菌體就行，而是要保持旺盛的生命力，所以，菌懸液存放時間不能太長。除黑曲霉孢子菌懸液外，其它試驗菌液使用期限不超過24h，并應置4℃冰箱保存。

結束語

綜上所述，通過開展驗證工作，積累了大量的經驗和數據，使無菌制劑的無菌檢查的驗證方法已經具有較明確的思路和方法，增加了試驗的可操作性；尤其強調應充分驗證供試品本身對微生物生長的影響，提高供試品的陽性檢出率，使無菌檢查方法更具科學性，保證檢驗結果的準確性，為控制無菌制劑的質量奠定了基礎。

參考文獻

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