氨酚曲馬多分散片微生物限度檢查方法學驗證

摘 要：本文按著《中國藥典》2010年版的檢測方法，對我公司生產的氨酚曲馬多分散片進行微生物方法學驗證，以確定檢測方法是否可行。

關鍵詞：氨酚曲馬多分散片；微生物限度檢查；方法學驗證

《中國藥典））2010版二部[1]規定，當建立產品的微生物限度檢査法時，應進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該產品的細菌、霉菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證。驗證時，按供試液的制備和細菌、霉菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。依據《中國藥典》2010年版二部附錄XIJ“微生物限度檢查法”，對氨酚曲馬多分散片的微生物限度檢查法進行了方法學驗證，驗證結果如下：

1 試驗材料

1.1 儀器：二級生物安全柜、壓力蒸汽滅菌器、電熱鼓風干燥箱、生化培養箱等。

1.2 供試樣品：氨酚曲馬多分散片，本公司生產，規格：鹽酸曲馬多37.5mg，對乙酰氨基酚325mg，批號：20140106。

1.3 標準菌種：金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003；大腸埃希菌CMCC（B）44102；枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501；白色念珠菌CMCC（F）98001；黑曲霉菌CMCC（F）98003。

1.4 試驗用培養基：營養瓊脂對照培養基，批號：135003-201103；玫瑰紅鈉瓊脂對照培養基，批號：135005-201103；膽鹽乳糖對照培養基，批號：135006-201104；營養肉湯對照培養基，批號：135004-201103；改良馬丁對照培養基，批號：135002-201002；曙紅亞甲藍瓊脂培養基，批號：051020；以上培養基均從中檢院購進。

1.5 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物接種于營養肉湯培養基中，30-35℃培養18-24小時，接種白色念珠菌的新鮮斜面培養物至改良馬丁培養基中，于23-28℃培養24小時，分別取上述培養液用0.9%的無菌氯化鈉溶液稀釋至10-6、10-7、10-5，10-5備用。取黑曲霉菌的新鮮斜面培養物，加5ml0.9%無菌氯化鈉水溶液，將孢子洗下，吸取菌液1ml至無菌比色管中，加適量0.9%的氯化鈉溶液，與標準比濁管比濁，取比濁后的菌懸液用0.9%的氯化鈉溶液稀釋至10-4，備用。

1.6 供試液制備

稱取本品10g，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，分散混勻使溶解，制成1：10供試液。

2 方法學驗證試驗[2]

2.1 細菌計數方法驗證

2.1.1 試驗組：取1：10供試液10ml，置無菌條件下離心（500轉/分）5分鐘，取上清液置無菌試管中，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液補足10ml，再從中取1ml加適量稀釋劑，依《中國藥典》2010年版二部附錄XIJ“微生物限度檢查法”中薄膜過濾法過濾，沖洗量300ml并在最后一次沖洗液中加入1ml相應的陽性試驗菌，取出濾膜，膜面朝上，貼于營養瓊脂平板上，按規定培養，測定氨酚曲馬多分散片的細菌數。

2.1.2 菌液組：取稀釋好的各菌液1ml，加9ml稀釋劑，低速離心——薄膜過濾（方法同試驗組）測定所加的試驗菌數。

2.1.3 供試品對照組：按試驗組方法，測定供試品本底細菌數。

2.1.4 稀釋劑對照組：取稀釋劑替代供試液，按試驗組的方法測定其菌數。

2.2 霉菌及酵母菌計數方法驗證

2.2.1 試驗組：取1：10供試液1ml加入陽性試驗菌1ml，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置規定條件培養，每種試驗菌平行制備二個平皿，測定其霉菌及酵母菌數。

2.2.2 菌液組：取稀釋好的各菌液1ml，方法同試驗組，分別加入平皿中，加入玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置規定條件培養，測定所加的試驗菌數。

2.2.3 供試品對照組：取規定量供試液，按菌落計數法測定供試品本底菌數。

2.2.4 稀釋劑對照組：取稀釋劑替代供試液，方法同試驗組。

試驗組菌回收率（%）= ■×100%

稀釋劑對照組菌回收率（%）=■×100%

試驗結果見表1。

2.3 控制菌檢查方法的驗證：常規法。

2.3.1 菌種

2.3.1.1 陽性菌：大腸埃希菌（44102）

2.3.1.2 陰性菌：金黃色葡萄球菌（26003）

2.3.2 試驗方法

2.3.2.1 試驗組：取1：10供試液10ml，加入100ml膽鹽乳糖增菌液中，再加1ml陽性菌（即大腸埃希菌濃度同細菌數驗證），搖勻，置35-37℃培養18-48小時依《中國藥典》2010年版二部附錄XIJ“微生物限度檢查法”中控制菌檢查法，檢查其控制菌，即大腸埃希菌。

2.3.2.2 陰性對照組：方法同試驗組，加入1ml陰性菌（即金黃色葡萄球菌濃度同細菌數驗證）。

試驗結果見表2。

3 結果判斷

3.1 計數法驗證

在三次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率均大于70%，試驗組的菌回收率均大于70%，故可照該供試液制備方法和計數法測定氨酚曲馬多分散片的細菌、霉菌及酵母菌數。

3.2 控制菌檢查法驗證

陰性對照組未檢出陰性對照菌，試驗組檢出陽性試驗菌，故可以照此供試液制備法和控制菌檢查法進行氨酚曲馬多分散片的控制菌檢查。

4 檢驗結果

表1 細菌、霉菌及酵母菌數驗證試驗（20140106）

表2 控制菌驗證試驗結果（20140106）

5 結論

經以上微生物方法學驗證，確定《中國藥典》2010版二部的方法適合于氨酚曲馬多分散片的細菌、霉菌及酵母菌數的測定。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄107-116.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品中國藥品檢驗標準操作規范

[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：351-369.

作者簡介：孫巍（1981，11-），女，漢族，齊齊哈爾醫學院，制藥工程專業工程師，多多藥業有限公司從事藥品質量管控工作。