轉Bt基因油菜的抗蟲性分析

萬麗麗　王轉茸　辛強　董發明　洪登峰　楊光圣

摘要：利用農桿菌介導的遺傳轉化分別將Cry1C和Cry2A的2個單價Bt基因轉入油菜（Brasica napusL.），以兩個純合的轉基因抗蟲油菜為親本，通過有性雜交的方法將不同Bt基因聚合，培育雙價Bt抗蟲油菜，并對其抗蟲性和種子品質性狀進行評價。結果表明，Cry1C、Cry2A在聚合后均能穩定表達，和單價Cry1C轉基因植株相比，雙價株系中蛋白質含量明顯降低，以Cry2A為母本的聚合株系蛋白質含量降低更多，Cry1C在遺傳上存在母本效應。室內接種小菜蛾二齡幼蟲結果顯示，轉化單價和雙價聚合Bt基因的抗蟲性增強，其中轉化單價Cry1C的抗蟲性優于雙價聚合Bt基因和單價Cry2A基因的轉基因植株。玻璃溫室栽培轉基因植株，單價Bt和雙價聚合Bt基因的轉基因植株能生存而非轉基因植株受到嚴重蟲害而死亡。對抗性優良的單價和雙價聚合的轉基因植株種子品質測定發現，與未受到蟲害的受體材料雙低優良恢復系7-5的含油量和硫苷含量差異不顯著，從而達到抗性改良的目的。

關鍵詞：油菜（Brassica napus L.）；蘇云金芽孢桿菌；Cry1C；Cry2A；雙價聚合；農桿菌介導遺傳轉化；品質性狀

中圖分類號：Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2386-06

油菜（Brassica napus L.）在生長發育過程中容易受到蟲害的侵襲，有10多種害蟲在油菜生產上能大面積發生并造成嚴重減產。近年來，氣候變化使得蟲害日趨嚴重。對農業生產造成損失。盡管使用化學農藥能夠取得良好的防控效果，但是農藥殘留對環境和人體的健康產生的危害已引起廣泛的關注。利用轉基因技術將抗蟲基因轉入油菜中，可以一定程度上改良油菜的抗蟲性。轉基因抗蟲植物最重要的基因來源于微生物的抗蟲基因，即蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因（Bt）。Bt殺蟲晶體被昆蟲攝入后，經歷了晶體蛋白溶解、原毒索酶解活化、與中腸受體結合、不可逆插入膜內、形成離子通道五個階段最后實現殺蟲效果。根據殺蟲晶體蛋白的殺蟲特異性以及氨基酸序列的同源性標準將發現的42種殺蟲蛋白基因分為7大類。其中類型Ⅰ（CryⅠ）抗鱗翅目（Lepidoptera）昆蟲，類型Ⅱ（CryⅡ）抗鱗翅目和雙翅目（Diptera）昆蟲，類型Ⅲ（CryⅢ）抗鞘翅目（Coleoptera）昆蟲，類型Ⅳ（CryⅣ）抗雙翅目昆蟲，CryⅤ對鱗翅目和鞘翅目以及線蟲特異，CryⅥ對線蟲特異，這六類統稱為晶體蛋白基因家族（Crvstalprotein gene，cry）。CrtA對雙翅目特異，與Cry基因完全不同，屬于細胞外毒索（Cvtolvtic protein，Cyt）。Bt產生的晶體蛋白對鱗翅目昆蟲具有特異的毒性，作為一種生物殺蟲劑在農業害蟲防治中廣泛應用。通過人工修飾Bt基因，如位點特異性突變的Crv3Bbl毒蛋白在玉米中表達可提高其對根蟲的抗性。1990年Monsanto公司首次在轉Bt抗蟲棉中獲得人工修飾的CryIA（6）和CryIA（c）基因，這2個基因在植株中蛋白含量占總可溶性蛋白的0.05%-0.10%。Cry基因與植物基因密碼子上的差異導致轉入植物體內轉錄過程形成二級結構，mRNA的穩定性下降以及翻譯效率降低，來自蘇云金芽孢桿菌的5個δ-內毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry2A和Cry9C能夠與蛀莖蟲三化螟和二化螟中腸不同受體位點結合，利用毒性蛋白與刷狀緣膜囊結合能力競爭性試驗分析得出不同Bt基因抗蟲效果的差異。華中農業大學水稻課題組人工合成Bt基因Cry1Ac、Cry2A、Cry1C和Cry9C轉入優良水稻恢復系明恢63中，獲得對兩種主要水稻鉆蛀害蟲三化螟和二化螟抗性優良的轉基因家系。對蘇云金芽孢桿菌的Cry1Cal進行截短，依據單子葉植物偏好來提高Bt基因的GC含量轉化到粳稻品種秀水11中能提高轉基因水稻對斜紋夜蛾和鉆蛀蟲的抗性。

隨著Bt作物的普遍商業化種植給目標昆蟲群體造成了極大的選擇壓，產生了昆蟲克服抗性的巨大風險。小菜蛾（Plutella xylostella）是遷飛害蟲，主要危害十字花科植物，對幾乎所有類型的化學殺蟲劑都產生過抗性。在1990年田間發現了對Bt蛋白產生抗性的小菜蛾，是首次在自然條件下發現對Bt殺蟲蛋白產生抗性的昆蟲，是長期使用Bt制劑的產物，可以利用不同Bt基因聚合延緩昆蟲抗性。Tu等2000年利用水稻ActinⅠ啟動子驅動兩個Bt基因cry1A（6）和cry1A（c）基因融合表達載體轉化明恢63恢復系和雜交種汕優63。Bt汕優63在自然條件以及室內接種水稻鉆蛀害蟲三化螟表現出很好的抗性，并且不會帶來產量損失。

本研究采用農桿菌介導法，以Bar基因作為抗性篩選標記，將華中農業大學水稻課題組人工合成的Bt基因Cry2A和Cry1C轉入到甘藍型油菜Pol-CMS優良恢復系材料7-5中，獲得抗蟲性改良的轉基因家系。另外。將分別轉化2個基因的植株雜交聚合，對雜交后純合轉基因家系進行抗蟲性評價，以期為轉Bt基因油菜的抗蟲性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的甘藍型油菜為華中農業大學油菜室所提供的優良PolCM雙低恢復系7-5。選取干凈飽滿油菜種子，75%乙醇消毒1min，0.1%HgCl₂溶液表面滅菌15min，無菌水沖洗3次，置于MS固體培養基上發芽。取生長6d的無菌苗下胚軸，用于試驗材料。植物表達載體pCAMBIA-Ubiquitin promoter-Cry1C和oCAMBIA-Ubiquitin promoter-Cry2A為華中農業大學水稻轉化課題組林擁軍教授提供。大腸桿菌Top10和根癌農桿菌GV3101由華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室油菜課題組保存。DNA聚合酶購自Promega公司，DNA marker購自Takara公司。田間噴施Basta購自Bayer公司。

1.2 方法

1.2.1 轉基因植株鑒定 采用農桿菌介導的遺傳轉化方法，以改造的pCAMBIA質粒作為載體，抗除草劑基因膦絲菌素乙酰轉移酶（Bar）基因作為選擇標記基因，以Cry1C和Cry2A分別轉化優良的油菜恢復系7-5。農桿菌菌株為GV3101，轉基因植物檢測的引物Crv2A-L（CGTGTCAATGCTGACCTGAT）、Cry2A-R（GATGCCGGACAGGATGTAGT）、Cry1C-L（TTCTACTGGGGAGGACGTCG）、Cry1C-R（CGGTATCTTTGGGTGATTGG）、Bar/L（GCTCAACACATGAGCGAAAC）、Bar-R（CGCACAATCCCACTATCCTF）。轉基因植株田間噴施除草劑Basta的濃度為500mg/L，苗期每7d噴施1次，連續21d。 1.2.2 轉基因植株Bt蛋白含量的測定 轉基因植株葉片中Bt蛋白濃度測定采用EnvironLogix公司（EnvironLogix。Portland，USA）的Bt蛋白ELISA檢測試劑盒，CryIC蛋白的測定使用了EnvironLogix公司ELISA檢測試劑盒QualiPlate^TMKit fo rCry1C，具體操作參考試劑盒說明。

1.2.3 小菜蛾二齡幼蟲室內和人工玻璃溫室中的抗性測定 待田間油菜生長至5-6葉期時，采集新鮮的葉片，剪成直徑為6（3m的圓盤。將圓盤放置于鋪有衛生紙的培養皿上，將10頭二齡幼蟲接種到每片葉子上，將接種材料置于人工氣候箱中。培養溫度25℃，濕度80%，光照3000lx，光周期16h光照/8h黑暗。檢測轉基因植株抗蟲效果，每個處理重復3次。記錄幼蟲取食72h后的平均重量、致死率和生長狀況。轉基因植株種植在人工玻璃溫室中，苗期觀察植株被害蟲取食的情況。

2 結果與分析

2.1 轉基因植株的獲得和鑒定

通過轉基因技術分別獲得了轉化Cry1C和Cry2A的植株，根據基因特異序列設計引物檢測單價抗蟲轉基因T。代植株，確定陽性轉基因植株。在田間將轉化不同單價抗蟲基因的轉基因植株正反交，其中獲得Cry1C×Cry2A（以Cry1C轉基因植株為母本，Cry2A轉基因植株為父本的雜交后代）和Cry2A×Cry1C（以Cry2A為母本。Cry1C為父本的雜交后代）植株，對其進行抗蟲基因的特異性標記分析（圖1）。將所獲得的轉基因植株種植在大田，用Basta噴施鑒定后發現陽性的轉基因植株都具有除草劑抗性（圖2）。

2.2 轉基因株系室內抗蟲性評價

選取單價抗蟲轉基因和聚合雙價抗蟲轉基因油菜植株的葉片喂食二齡小菜蛾幼蟲（圖3A、B、C），72h后統計喂食幼蟲的蟲重，結果表明，與野生型7-5相比較，轉化單價Cry2A基因的轉基因油菜植株喂食后蟲重下降，差異顯著。而轉化單價Cry1C基因以及雙價抗蟲基因聚合后的轉基因油菜植株葉片喂食后，小菜蛾幼蟲蟲重出現了顯著或者極顯著下降，進一步證明了轉化抗蟲基因能夠有效地提高油菜抗小菜蛾幼蟲能力（圖3D、表1）。

由于轉化Cry1C基因的轉基因植株的抗蟲性表現極顯著優于對照，選取單價轉化Cry1C的T₁代轉基因3個家系共21個植株的葉片和雙價聚合轉基因植株6個家系共38個植株的葉片，測定其Cry1C蛋白的含量，結果顯示在轉化Cry1C基因的轉基因植株中Cry1C蛋白平均含量高于聚合Cry1C和Cry2A基因的轉基因植株中的蛋白含量（圖4）。

2.3 轉基因株系在玻璃溫室中的抗蟲性

將轉化單價抗蟲基因和雙價抗蟲基因的轉基因油菜植株于4月底種植在人工玻璃溫室中，觀察蟲害對轉基因幼苗的影響（圖5），可見轉化單價Cry1C基因的轉基因植株抗蟲性表現最優。

2.4 轉基因株系種子品質評價

抗蟲轉基因油菜遇到蟲害時自身會啟動一些防御反應，同時植物會消耗自身的能量從而導致產量和品質的下降。轉基因受體材料7-5是優良雙低恢復系油菜，抗蟲基因Cry1C和Cry2A在泛素啟動子作用下在7-5材料中組成型表達，一定程度上會使植株產生代謝負荷，油菜子的品質受到影響。因此，對單價和雙價聚合的轉基因植株種子品質進行測定（表2），與對照7-5相比較，Cry1C×Cry2A聚合轉基因家系油酸C18：1含量顯著增加，二十碳烯酸C20：1含量極顯著下降。Cry1C轉基因T₁代兩個家系二十碳烯酸C20：1含量極顯著高于7-5。Cry2A轉基因T₁代家系二十碳烯酸C20：1含量顯著高于7-5。對種子中含油量和硫苷進行分析得出，所有的轉基因家系與7-5對照相比較差異不顯著（圖6）。

3 討論

3.1 Bt基因在轉基因后代中的遺傳

為了獲得優良抗蟲表型的轉基因家系，對抗蟲表現不一致的T₀代轉基因植株的選擇是育種過程中的必要步驟。本試驗所獲得的T₁代都來源于轉基因插入位點為一個拷貝并且抗蟲表現優于轉基因受體對照7-5的T₀代植株。對T₁代進一步的選擇按照以下原則：①單價Bt基因穩定遺傳的純合株系：②抗蟲表型穩定有效：③與7-5相比沒有明顯的表型變異，產量和品質不受影響。將純合的單價抗蟲Cry1C和Cry2A轉基因植株雜交獲得雙價轉基因油菜，其中以Cry1C為母本獲得的聚合油菜抗蟲性優于以Cry2A為母本獲得的聚合油菜，這一結果與單價抗蟲Cry1C基因轉化所得的抗性高于轉化Cry2A基因植株的抗蟲性相一致，證明了Cry1C轉基因植株作為母本傳遞核物質有著母體效應。

3.2 Bt基因聚合的重要性以及有性雜交聚合的優勢

本試驗在甘藍型油菜7-5中導入兩個Bt基因，若2種毒素能夠識別有差異的受體，那么昆蟲對他們同時產生抗性的幾率會降低。因為2種與昆蟲類受體結合的毒蛋白同時失效的可能性不大，雙價Bt抗蟲轉基因植株能夠有效地延遲抗性失效的時間。在大田環境下，油菜容易遭受多種蟲害危害，聚合多個Bt基因能夠產生很好的防控作用，同時可以有效延緩抗性品種的應用時間。在美國和澳大利亞等國家主要采用高劑量和庇護所同時種植，即大田環境下種植Bt作物的同時需要種植一些非轉基因的植株來維持一定數量的敏感昆蟲個體。那么雙價Bt作物所需要的庇護所比例較小，可以將經濟損失降到很低。但是中國的種植制度、農戶規模以及靶標害蟲等社會和生態環境不同，這種高劑量庇護所策略在中國推廣實施較困難，因而通過雙價或者多價基因聚合更符合國情需求。

在本試驗中通過有性雜交的方式進行基因聚合，首先分別獲得純合的單價Bt轉基因家系，將它們雜交后再次選擇純合株系。這個過程中需要對兩個隨機插入到基因組的Bt基因同時進行標記篩選，經歷的時間長工作量大。但這種方法在實際育種材料的改良應用中存在著一定優勢，首先將現有的多個育種材料作為受體進行單價Bt基因轉化，獲得變異小抗性和農藝性狀穩定優良的家系，之后可以根據不同育種需求將含有單價Bt基因的材料自由組配，實現父母本家系的優勢互補，改良產量、品質等性狀，從而提高獲得理想材料的機會，這樣可以避免對每個組合進行雙價或者多價基因的遺傳轉化。

3.3 雙價Bt抗蟲轉基因葉片中Cry1C蛋白含量與單價Cry1C蛋白的差異

本試驗中單價抗蟲基因Cry1C和Cry2A都是在來源于玉米的組成型啟動子Ubiquitin promoter作用下實現表達的。盡管這兩個Bt基因在序列上沒有極高的相似性，但是二者聚合后由于啟動子的完全同源會引起基因沉默導致抗蟲基因表大量下降。對Cry1C蛋白含量檢測發現，雙價轉基因家系中蛋白濃度普遍低于單價Cry1C轉基因植株。在實際應用中采用不同的啟動子，如CaMV35S和Actin作用聚合不同的Bt基因表達可以降低聚合后基因表達量下降以及基因沉默失效的機率。另外，組成型表達的啟動子在植物的各個器官表達勢必造成能量的消耗而產生代謝損耗，并且種子中Bt蛋白的含量高會引發消費者對轉基因食品安全的質疑。因此，利用組織特異啟動子，如水稻rbcS（1，5-二磷酸羧化酶或者加氧酶的小亞基）啟動子驅動Bt抗蟲基因在葉片、莖稈組織中特異表達可以提高抗蟲的有效性。Bt基因持久高效的表達會影響植株的其余性狀的變異，如株高、育性等。增加對田間昆蟲的選擇壓。加速昆蟲的抗性變異，最終導致植物抗性喪失。因此。選擇農藝和品質性狀變異少?？瓜x性優良而Bt蛋白含量較低的轉基因家系應用于大田可以有效地避免上述問題，