根癌農桿菌介導水稻成熟胚及抗褐飛虱基因植株的獲得

李三和　韓光明　閘雯俊　劉凱　胡剛　游艾青

摘要：以水稻（Oryza sativa L.）秈型兩系恢復系M5274和晚粳稻不育系N55S成熟胚為材料，以攜帶有雙元載體的根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105為載體進行抗飛虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl的遺傳轉化，共獲得515棵再生植株，包括198株Bph14轉基因植株、72株Bphi008A轉基因植株和245株Osz！轉基因植株。PCR檢測結果表明，獲得的515株再生植株中，有244株陽性轉基因植株，3個不同抗褐飛虱基因中，轉Bvh14基因的再生苗陽性率最高，增加篩選次數能有效減少轉化所得的假陽性植株。

關鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）介導轉化；抗褐飛虱基因

中圖分類號：S511 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2392-04

近年來，褐飛虱遷入中國的蟲量大，由于目前大多數水稻（Orvza sativa L.）品種不抗蟲，尤其是一些主要的雜交稻品種，對褐飛虱等蟲害還有“超感蟲性”（hyper-susceptibility）。目前，水稻褐飛虱已經成為一種爆發力強、對水稻危害性極大的蟲害。由于褐飛虱的危害多發生在水稻成熟灌漿期，此時若大量使用殺蟲劑，對水稻的污染會非常嚴重，這也是中國水稻生產中迫切需要解決的重要問題。研究證明，利用抗褐飛虱基因培育抗蟲水稻品種是褐飛虱綜合防治中經濟有效的方法。通過轉基因技術與常規育種技術相結合培育抗褐飛虱水稻品種，有效控制褐飛虱的發生與危害，可確保中國水稻生產持續穩定發展和國家糧食安全。根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導的轉化系統是對天然載體轉化系統的一種模仿，已在水稻轉基因育種及功能基因組研究中被廣泛應用，1994年以后，由于技術上的突破。相繼在不同水稻品種中獲得成功，轉化效率也大大提高，如粳稻的轉化率一般在30%左右，最高可達到64.6%。本研究以育種上應用的典型秈型兩系恢復系M5274和晚粳稻不育系N55S為材料，利用根癌農桿菌介導法對褐飛虱抗性基因Bph14、Bphi008A、Osgl進行遺傳轉化，目的是通過3個抗褐飛虱基因的導入，探索水稻抗褐飛虱育種的新途徑，以期提高其產量和品質。

1 材料與方法

1.1 植物受體材料

兩系恢復系M5274、晚粳稻不育系N55S，由湖北省農業科學院糧食作物研究所選育。

1.2 農桿菌菌株與質粒載體

根癌農桿菌菌株EHA105，質粒PCAMBIA1300的T-DNA區含有潮霉素抗性基因（Hyg^r），抗褐飛虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl由武漢大學提供。

1.3 材料的處理及接種

選取健康飽滿無病斑的成熟種子，除去穎殼，用75%乙醇浸泡1min，然后將種子置于新配制的0.1%氯化汞溶液中，攪拌10-12min。滅菌后用無菌水沖洗4-5次，最后將種子取出置于無菌濾紙上，待種子表面干燥后，以平擺法將其接種于各自不同的誘導培養基上，每瓶12-14粒。每個品種接30瓶。

1.4 水稻組織培養

粳稻組織培養培養基見表1，秈稻組織培養基為LY培養基，購自武漢博遠生物科技有限公司。將成熟胚表面按“1.3”的方法消毒后接種于愈傷組織的誘導培養基上。

1.5 農桿菌的培養及其介導的水稻轉化

根癌農桿菌的培養及其介導的轉化過程參照Hiei等的方法。

1）劃菌：取轉化后經檢測有所需載體的農桿菌保存菌液5-10μL，至YEB（加入濃度為100mg/L的卡那霉素）的固體培養基上涂板，30℃黑暗培養，直到長出單菌落。將單菌落二次劃線培養農桿菌24-36h，刮菌體于懸菌培養基中，30℃180r/min搖菌3-4h，調整菌液OD_600nm至所需值。

2）侵染：用懸浮培養基稀釋菌液，直到OD_600nm為0.1-0.9，將含農桿菌菌液倒入已放好愈傷的培養瓶中，根據菌液濃度在30℃搖床上侵染5-30min。倒掉菌液，用滅菌的濾紙將菌液吸干，用鑷子把愈傷組織轉移到共培養培養基上，20℃黑暗培養48-72h。

3）洗菌：把共培養基上的愈傷組織轉入滅菌三角瓶中，用無菌水清洗5-6次，直到水不再渾濁。然后加入滅菌水（含有500mg/L頭孢霉素）120r/min28℃搖菌15-20min。

4）晾干愈傷：把水倒掉，把愈傷組織轉移到放有滅菌濾紙的培養皿中，在超凈臺吹40-50min。

5）把晾干的愈傷組織轉移到篩選培養基上進行篩選培養，分別進行一輪和兩輪篩選培養。每輪25d左右，比較篩選的有效性。

6）把篩選出的抗性愈傷組織進行預分化、分化和生根培養。

1.6 轉基因水稻植株的PCR鑒定

1.6.1 轉基因植株總DNA的提取 按CTAB法從水稻新鮮葉片中提取總DNA。

1.6.2 潮霉索抗性基因的PCR檢測 根據轉化載體中Hyg^r基因DNA片段的序列設計引物進行PCR擴增，PCR引物為Primer1（5'-GCCTGACCTATTG-CATCTCC-3'）、Primer2（5'-CCTCGCTCCAGTCAAT-GACC-3'）。PCR反應體系：總體系為20txL，DNA模板50ng，10xbuffer2，0μL，2mmol/L dNTP1.5μL，25mmol/L MgCl₂2.0μL，10μmol/L引物各0.4μL，Taq酶1U。加滅菌ddH₂O至20μL。PCR反應程序：94℃變性3min：94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，35個循環：72℃延伸5min。

1.6.3 目的基因Bph14的檢測 根據Bph14基因序列設計引物，檢測水稻的基因組DNA中是否含有該基因。PCR擴增引物：正向5-GGCAGATCATCACCAACTCC-3，反向5-GGCGACTGCGAATGCTAT-3，產物大小為566bp。PCR反應體系：總體系為20μL，DNA模板50ng，10×buffer2.0×L。2mmol/LdNTP1，5μL，25mmol/LMgCl₂2.0×L，10μmol/L引物各0.4μL，Taq酶1U，加滅菌ddH₂O至20μL。PCR反應程序：94℃。變性5min：94℃，變性1min。58℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環：72℃延伸5min。

2 結果與分析

2.1 粳稻N55s轉基因植株的獲得

根癌農桿菌介導粳型稻N55S只進行第一輪篩選后，分化生根，獲得轉Bph14基因的總苗數為40株，陽性株數21株，陽性植株比率為52.5%：獲得轉Bphi008A基因的再生苗16株，其中抗性植株5株，陽性植株比率為31.3%：獲得轉Osgl基因的再生苗35株，其中陽性植株12株。陽性植株比率為34.3%。進行兩輪篩選后。分化生根。獲得轉Bph14基因總苗數為45株，其中陽性植株27株，陽性植株比率為60.0%：獲得轉Bphi008A基因總苗數22株，其中陽性株數為8株，陽性植株比率為36.4%：獲得轉Osgl基因總苗數94株，其中陽性植株36株，陽性植株比率為38v3%（表2）。根癌農桿菌介導粳型稻N55S轉抗褐飛虱基因的結果表明，不論是一輪篩選還是兩輪篩選，Bph14基因轉化效率最高，Bphi008A基因轉化效率最低，Osgl基因轉化效率居中，但Bphi008A基因與Osgl基因轉化效率相差不大。

2.2 秈稻M5274轉基因植株的獲得

根癌農桿菌介導秈型稻M5274經第一輪篩選后，分化生根，獲得轉Bph14基因總苗數46株，陽性株數35株，陽性植株比率為76.1%：獲得轉Bphi008A基因26株轉基因苗，其中抗性植株2株，陽性植株比率為7.7%；獲得轉Osgl基因19株轉基因苗，陽性植株6株，陽性植株比率為31.6%。第二輪篩選后，獲得轉Bph14基因再生苗數為67株，其中陽性植株55株。陽性植株比率為82.1%：獲得轉Bphi008A基因再生苗數8株，其中陽性株數為2株。陽性植株比率為25.0%：獲得轉Osgl基因再生苗97株，其中陽性植株35株，陽性植株比率為36.1%（表3）。與前面結果類似，根癌農桿菌介導秈型稻M5274轉抗褐飛虱基因試驗中，增加篩選可以提高獲得陽性再生苗的比例，且Bph14基因轉化效率最高。其次是Osgl基因，Bphi008A基因轉化效率最低。

2.3 PCR檢測

為了獲得轉基因的直接證據，提取了轉基因植株的葉片總DNA，除了進行了PCR擴增檢測潮霉索抗性基因Hyg^r外。部分轉化Bph14基因的材料還檢測了目的基因。結果表明，轉基因植株中均能擴增到566bp潮霉素抗性基因Hyg^dr的DNA條帶，呈陽性反應，而未轉基因植株則沒有擴增到DNA條帶（圖1），從而證明目的基因已整合到轉基因植株中。

3 討論

農桿菌介導的基因轉化技術是水稻基因轉化的首選方式。農桿菌介導轉化方法的優點是轉化效率高。轉基因重排比例少，插入拷貝數少。單拷貝數植株比例高。影響農桿菌轉化效率的因素有菌株類型、水稻基因類型、培養基成分組成、組織培養條件等。不同水稻品種需要不同的轉化條件，愈傷組織經過多代培養后易產生體細胞突變，不利于轉化體的篩選：同時，多代培養后愈傷組織衰老死亡，轉化效率降低。作者曾將未經繼代培養的愈傷組織進行轉化，發現轉化效率也很低，這說明細胞的周期狀態影響轉化效率。已有研究表明，當愈傷組織處于細胞周期S期和G2期的比例最高時，轉化效率最高，S期是細胞DNA復制期。此時轉化有利于轉入的T-DNA鏈轉變成雙鏈，增加遺傳和整合的穩定性。黃紅梅等研究結果表明，愈傷組織經過繼代培養6-7d后轉化率高達95%，本研究通過已優化的粳稻培養基體系和秈稻培養基試劑盒分別對粳稻N55S和秈稻M5274進行抗褐飛虱基因根癌農桿菌介導的遺傳轉化，其中粳稻和秈稻轉化效率分別為42.5%和45.5%，但3種抗褐飛虱基因對粳稻和秈稻的轉化效率不同，其中Bph14最高，Bphi008A最低，Osgl居中。粳稻和秈稻各自不同時期轉化效率的差異可能和組織培養條件和抗褐飛虱基因有密切關系，有待進一步研究。