CCNG2基因過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺癌裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)研究

梁會(huì)杰 劉閣玲

【摘 要】 目的 利用人K1甲狀腺癌移植型裸鼠模型，探討細(xì)胞周期蛋白G2（cyclin G2）的體內(nèi)抑制腫瘤效應(yīng)。方法 將18只4周齡SPF級(jí)BALB/C雌性裸鼠編號(hào)，隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組和CCNG2基因轉(zhuǎn)染組，每組6只。常規(guī)擴(kuò)大培養(yǎng)三種細(xì)胞，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化后重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，0.2ml/只（終濃度為5×107）于裸鼠右側(cè)腋窩皮下按組別接種建立甲狀腺癌動(dòng)物模型，同時(shí)游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的長(zhǎng)軸、短軸計(jì)算移植瘤體積，繪制生長(zhǎng)曲線。30天后斷頸處死所有組別的裸鼠，摘取瘤組織，免疫組織化學(xué)檢測(cè)CCNG2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 所有組別裸鼠全部成瘤，成瘤率100%（18/18）。CCNG2基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞組裸鼠成瘤時(shí)間延遲、瘤組織體積及生長(zhǎng)速度緩慢，平均體積明顯小于空白對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組（F=54.983，P<0.001），體積抑瘤率分為67.07%、62.32%。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果示：LV-CCNG2轉(zhuǎn)染組染色陽(yáng)性指數(shù)分別為9.79±0.658，與空白對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組染色指數(shù)4.659±0.371和4.719±0.367相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 慢病毒介導(dǎo)CCNG2過(guò)表達(dá)于人K1甲狀腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞周期蛋白G2（CCNG2）；甲狀腺癌；K1細(xì)胞；慢病毒；裸鼠

The effects of human CCNG2 gene overexpress in nude mice of Thyroid carcinoma

LIANG Hui-Jie， LIU Ge-Ling

（1.Department of Endocrinology，the Workers hospital affiliated， North China university of

technology，Tangshan 063000，China；2. Department of Endocrinology，the Workers hospital，Tangshan 063000，China）

ABSTRACT：【Objective】To explore cyclin G2 in vivo antitumor effect in nude mice implanted with K1 thyroid cancer cells.【Methods】Choosing four-week-old SPF BALB/C female mice （n=18）. Then separated them into three groups at random： blank control group （K1）， LV-CCNG2 transfected group and negative control group . K1 thyroid cancer cells were culture， and 0.2ml （5x107/ml） of cell suspension were injected in to the subcutaneous tissue of back to establish BALB/C nude mice eth otopic transplantation tumor model. We measured the long and minor axis of the transplanted tumors using slide caliper， drew the growth curve of them. All groups of the nude mice were breaking the neck todeath on the 30th day. The expression CCNG2 was measured by IHC . To observe the inhibitory effect of CCNG2 over expression on tumor in vivo.【Result】The rate of tumorigenesis in each group was 100%. There was significant difference on tumor size in three groups （F=54.983，P<0.001）. Compared with negativecontrol group and blank control group， the tumor inhibition rate of LVCCNG2 transfected group was 67.07% and 62.32%. Analysis the expression of CCNG2 protein in each groups transplanted tumor samples by using immunohistochemistry： The staining positive rates of CCNG2 in LV-CCNG2 transfected group， negative control group and blank control group are 9.79±0.658， 4.659±0.371 and 4.719±0.367. There was significant difference on tumor weight in three groups （P<0.05）.【Conclusion】The growth of human thyroid cancer K1 cells transfected with CCNG2 was significantly inhibited in nude mice.

KEY WORDS： cyclin G2（CCNG2）；thyroid；K1 cell；lentivirus；Nude mice

甲狀腺癌（Thyroid carcinoma，TC）是一種比較常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率在過(guò)去幾十年中不斷增加。盡管通過(guò)手術(shù)和放射性碘標(biāo)準(zhǔn)治療后，能夠擁有良好的預(yù)后反應(yīng)和長(zhǎng)期生存率。但是患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或放射性碘難治性疾病時(shí)只有15%～20%的10年生存率。因此，針對(duì)甲狀腺癌的分子靶向治療成為醫(yī)療領(lǐng)域迫切需要解決的問(wèn)題。人類細(xì)胞周期蛋白G2（cyclin G2）是新發(fā)現(xiàn)的周期蛋白，參加調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和癌變與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。研究顯示，在眾多的人類癌癥的逐步進(jìn)展模型中CCNG2的表達(dá)著降低，如口腔癌[1]、卵巢癌[2]、乳腺癌[[3-4]、胃癌[5]、食管癌[6]，并且其表達(dá)與更高級(jí)別的癌癥進(jìn)展呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。但在甲狀腺乳頭狀癌中的作用報(bào)道較少。研究中我們通過(guò)慢病毒介導(dǎo)CCNG2基因過(guò)表達(dá)建立裸鼠移植瘤模型，觀察對(duì)裸鼠移植瘤抑制作用；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CCNG2蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況，為甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要實(shí)驗(yàn)試劑

甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株購(gòu)自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)中心（CAMR，Salisbury，UK）。兔抗人CCNG2抗體夠自于英國(guó)EterLife公司，免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，CCNG2過(guò)表達(dá)慢病毒購(gòu)自上海漢恒生物技術(shù)有限公司（Hanbio CO.LTD）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3～4周齡SPF級(jí)BALB/C雌性裸鼠，體重15～18g，16只，購(gòu)自于北京輝奧生物技術(shù)有限公司（合格證編號(hào)：SYXK（冀）2015-0038），飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.3.1 慢病毒轉(zhuǎn)染K1細(xì)胞 LV-CCNG2過(guò)表達(dá)慢病毒以感染復(fù)數(shù)MOI=50時(shí)感染K1細(xì)胞，加入濃度為5mg/ml的感染增強(qiáng)劑Polybrene；感染96個(gè)小時(shí)后，加入濃度為4μg/ml 嘌呤霉素（Puromycin）篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.2 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的三種細(xì)胞消化后重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，0.2ml/只（終濃度為5×107）于裸鼠右側(cè)腋窩皮下按組別接種建立甲狀腺癌異種移植瘤模型，同時(shí)游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的長(zhǎng)軸、短軸計(jì)算移植瘤體積，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 斷頸處死裸鼠，摘取瘤組織，常規(guī)石蠟包埋，組織標(biāo)本切成4μm厚的切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，置于梯度乙醇中浸泡脫水，加入濃度為3%H2O2的溶液浸泡切片，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，在0.01mmol/L檸檬酸緩沖液中高壓鍋加熱使其溫度保持在130℃左抗原修復(fù)。入濕盒加10%正常封閉山羊血清封閉，37℃孵育20min。加入CCNG2稀釋后的抗體（稀釋度為1：200），4℃濕盒過(guò)夜。第二天向組織切片上滴加Ⅱ抗，濕盒內(nèi)37℃靜置30min，之后滴加DAB顯色劑顯色，蘇木精伊紅復(fù)染2min，常規(guī)鹽酸酒精脫水。最后透明、封片、鏡檢。結(jié)果判定：依據(jù)參考文獻(xiàn)建立CCNG2、蛋白表達(dá)陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)，CCNG2陽(yáng)性表達(dá)主要為胞質(zhì)染成淺黃色、棕黃色或黃褐色。在高倍鏡下（400×）隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞陽(yáng)性百分率（≤5%=0分，>5%～25%=1分，>25%～50%=2分，>50%=3分）及細(xì)胞染色強(qiáng)度（無(wú)染色=0分，淺黃色=1分，黃褐色色=2分，棕黃色=3分）得分之和進(jìn)行判定。兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相加后評(píng)判： 0分為陰性，1～6分為陽(yáng)性。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用Excel2003軟件將全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)建庫(kù)，利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間及同一時(shí)間點(diǎn)多組間的比較采用單因素方差分析（ANOVA）。采用檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染K1細(xì)胞的效率 在慢病毒轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置MOI=10、30、50、80，結(jié)果證實(shí)MOI=50，轉(zhuǎn)染效率最高，大于90%（見(jiàn)圖1）。

2.2 移植瘤生長(zhǎng)曲線及體積抑瘤率 接種三組不同的腫瘤細(xì)胞30天后，觀察發(fā)現(xiàn)18只裸鼠全部成瘤，成瘤率100%（18/18）。在三組不同細(xì)胞接種裸鼠成瘤后連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，CCNG2基因轉(zhuǎn)染組裸鼠成瘤時(shí)間延遲、瘤組織體積及生長(zhǎng)速度緩慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)平均腫瘤體積為543.42±222.91mm3，明顯小于空白組和陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組，與空白組和陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，LV-CCNG2轉(zhuǎn)染組體積抑瘤率分別為67.07%、62.32%差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=54.983，P<0.05）。空白組及陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比較，移植瘤的生長(zhǎng)趨勢(shì)均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。（見(jiàn)表1、圖2、圖3）

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果 CCNG2蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要為胞質(zhì)染成淺黃色、棕黃色或黃褐色：LVCC N G 2轉(zhuǎn)染組移植瘤（C）染色陽(yáng)性指數(shù)為9.79±0.658，其與K1細(xì)胞組和陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；K1細(xì)胞組移植瘤（A）染色陽(yáng)性指數(shù)為4.659±0.371，陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組移植瘤（B）染色染色陽(yáng)性指數(shù)為4.719±0.367，兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見(jiàn)圖4）

甲狀腺癌（Thyroid carcinoma，TC）是最常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%～5%，并以每年6.2%的速度在全球范圍內(nèi)持續(xù)快速增長(zhǎng)。近年來(lái)，我國(guó)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)甲狀腺癌發(fā)生率明顯升高，其增長(zhǎng)速度是過(guò)去10年的2倍左右。因此，針對(duì)甲狀腺癌的分子靶向治療成為醫(yī)療領(lǐng)域迫切需要解決的問(wèn)題。CCNG2基因最初發(fā)現(xiàn)于1996年，其編碼的蛋白質(zhì)與CCNG1同屬于細(xì)胞周期蛋白家庭。研究報(bào)道顯示，CCNG2是一個(gè)已知的腫瘤抑制基因，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡與瘤腫生長(zhǎng)過(guò)程及預(yù)后轉(zhuǎn)歸息息相關(guān)。研究表明，CCNG2基因是多條抑制腫瘤發(fā)展信號(hào)通路的中間分子，一些腫瘤抑制基因通過(guò)促進(jìn)CCNG2的表達(dá)防止細(xì)胞的過(guò)度增值。Mourgues[7]等發(fā)現(xiàn)在慢性粒細(xì)胞白血病的進(jìn)展到急性階段的過(guò)程中，BMI1與CCNG2呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，因此推測(cè)沉默CCNG2介導(dǎo)的腫瘤抑制自噬應(yīng)答可以誘導(dǎo)BMI1促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病的急性期轉(zhuǎn)變。Salem[8]等研究發(fā)現(xiàn)CCNG2通過(guò)與β-catenin在粘附連接處形成復(fù)合物，將其錨定在膜上并且抑制其他下游靶基因的激活網(wǎng)絡(luò)，從而抑制了Wnt/βcatenin信號(hào)通路中E-cadherin的表達(dá)，從而達(dá)到抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。

本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)建立裸鼠移植瘤模型，從體內(nèi)試驗(yàn)角度探討它在甲狀腺乳頭狀癌中的情況。結(jié)果顯示，LV-CCNG2基因轉(zhuǎn)染組移植瘤生長(zhǎng)速度、移植瘤體積明顯低于空白對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組，移植瘤出現(xiàn)明顯的增殖移植。免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)同時(shí)顯示，CCNG2蛋白在轉(zhuǎn)染組表達(dá)明顯升高，轉(zhuǎn)染組瘤組織出現(xiàn)明顯的抑制，這表明CCNG2蛋白過(guò)表達(dá)能夠抑制甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，轉(zhuǎn)染CCNG2的人K1甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)治療裸小鼠乳腺癌有顯著的抑制作用。為今后以CCNG2為中心的靶向治療提供了新方向。

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