棗莊石榴根結(jié)線蟲的鑒定

夏彥飛　喬俊卿　張雪雯　楊列祥

摘要：采用形態(tài)鑒定法、同工酶法、PCR法對山東省棗莊市榴園鎮(zhèn)石榴園一株枯死石榴樹的根結(jié)線蟲樣本進(jìn)行了鑒定，病原線蟲鑒定為南方根結(jié)線蟲。

關(guān)鍵詞：石榴；根結(jié)線蟲；鑒定

根結(jié)線蟲是植物寄生線蟲中危害重、寄主廣泛的一類線蟲，目前為止，已經(jīng)近百種。根結(jié)線蟲通過2齡幼蟲侵入寄主根系維管束后固定取食并發(fā)育為成蟲，線蟲在發(fā)育過程中干擾寄主植物的正常生理過程，導(dǎo)致寄主植物呈現(xiàn)特異性的根結(jié)病害癥狀。石榴樹是一種原產(chǎn)自西域的果樹，經(jīng)絲綢之路傳至中原，因其樹姿優(yōu)美，花期長，且果實(shí)營養(yǎng)豐富，是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的樹種之一。山東省棗莊市是中國重要的石榴產(chǎn)區(qū)之一，隨著石榴樹齡的增長、樹勢的衰弱及病蟲的侵害，常常導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)甚至樹木死亡，這一問題已成為棗莊石榴產(chǎn)業(yè)發(fā)展和農(nóng)民增收的重要障礙。根結(jié)線蟲病是石榴樹常見病害之一，由于其破壞根系影響?zhàn)B分的疏導(dǎo)，特別是對樹齡較高的石榴樹危害更大。已報(bào)道危害石榴樹的根結(jié)線蟲有多個(gè)種，山東棗莊地區(qū)根結(jié)線蟲種類尚不明確。本研究通過會(huì)陰花紋特征，采用形態(tài)鑒定法、SCAR-PCR法、同工酶法對山東省棗莊市榴園鎮(zhèn)石榴園一株枯萎石榴樹的根結(jié)線蟲樣本進(jìn)行種類鑒定。

1.材料與方法

1.1雌蟲會(huì)陰花紋的形態(tài)觀察

用挑針挑取棗莊市榴園鎮(zhèn)石榴園枯萎石榴植株根結(jié)中的雌性成蟲，放在含有45%乳酸溶解液的載玻片上，在解剖鏡下用解剖刀切取蟲體的會(huì)陰部角質(zhì)膜，輕輕剔除內(nèi)含物，清洗干凈后，將角質(zhì)膜置于甘油中制成永久玻片，顯微鏡下觀察會(huì)陰花紋特征。

1.2SCAR-PCR分析

SCAR-PCR擴(kuò)增所用的特異性引物參考Dong等和Meng等（表1），引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。PCR反應(yīng)所用的試劑購買于大連寶生生物公司。

將挑出的石榴根結(jié)單卵塊清洗干凈后放入含有無菌水的凹面皿中，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中分離根結(jié)線蟲2齡幼蟲待用。以已知的花生根結(jié)線蟲MA、南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）MI、北方根結(jié)線蟲MH、爪哇根結(jié)線蟲MJ4種線蟲的DNA作為對照。

為了保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，PCR反應(yīng)所用的DNA模板為單條線蟲的DNA樣品。單條線蟲的DNA提取參考Wang等、王江嶺等的方法。單條線蟲挑入含有8 μL無菌水的潔凈凹皿中，在解剖鏡下用挑針把線蟲切成2-3段：然后把含有線蟲的裂解液轉(zhuǎn)移到200 μL的PCR管中，放入液氮中處理5 min，置于65℃水浴3 min（重復(fù)2-3次）：PCR管中加入2 μL的5×裂解緩沖液（10xEx Taq PCR Buffer 100 μL，10μg/L蛋白酶K 10μL，ddH₂O 90μL），65℃加熱1 h，95℃加熱10min，得到DNA。提取液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3同工酶分析

酯酶、蘋果酸脫氫酶操作步驟參照Esbenshade等的研究方法，對從供試樣本中挑出的成熟雌蟲進(jìn)行同工酶電泳分析。以實(shí)驗(yàn)室保存的番茄南方根結(jié)線蟲種群作為對照組。

2.結(jié)果與分析

2.1雌蟲會(huì)陰花紋形態(tài)的觀察

供試石榴根結(jié)線蟲雌成蟲會(huì)陰花紋線紋緊密、波浪狀，呈橢圓或近圓形，無明顯的側(cè)線，背弓較高，背弓頂部圓或平（圖1）。根據(jù)劉維志的描述，供試根結(jié)線蟲樣本屬于南方根結(jié)線蟲。

2.2 SCAR-PCR電泳檢測結(jié)果

由圖2可知，所用的4對根結(jié)線蟲特異性引物只有南方根結(jié)線蟲的特異性引物（MI）從供試樣本中擴(kuò)增出955 bp的條帶（泳道1），和對照泳道2擴(kuò)增的條帶一致，其余的三對特異性引物（MH、MA、MJ）沒能從供試樣本（泳道3、5、7）中擴(kuò)增出特異性條帶，設(shè)置的對照組（泳道4、6、8）都能擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性條帶（1 500、950、517 bp），結(jié)果表明，此枯萎石榴樹根結(jié)線蟲病害的病原物為南方根結(jié)線蟲。

2.3同工酶鑒定

供試根結(jié)線蟲的酯酶（Est）一條主帶，電泳相對遷移率（Rm）約0.47，為II型；蘋果酸脫氫酶（Mdh）為單條酶帶，Rm約0.23，為N1型。蘋果酸脫氫酶和酯酶的同工酶譜型與對照線蟲南方根結(jié)線蟲的譜型完全相同（圖3）。

3.小結(jié)與討論

目前，在中國危害的根結(jié)線蟲類群有39種，其中南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲4種根結(jié)線蟲造成的損失占90%以上。準(zhǔn)確鑒定根結(jié)線蟲的類群是開展線蟲病害防治及其相關(guān)研究的基礎(chǔ)，形態(tài)鑒定法、同工酶譜法、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等是根結(jié)線蟲種類鑒定的常用方法。形態(tài)鑒定法操作方便簡單，但是種內(nèi)及種間存在變異，鑒定結(jié)果存在一定的不確定性。同工酶譜鑒定法僅對發(fā)育成熟的雌蟲進(jìn)行鑒定，但其可靠性高，在根結(jié)線蟲常規(guī)種類鑒定中經(jīng)常使用。基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)鑒定法準(zhǔn)確可靠、檢測靈敏，適用于線蟲各發(fā)育階段，是近年來發(fā)展較快的根結(jié)線蟲鑒定方法。為了避免單一方法鑒定線蟲存在的不可靠性，本研究分別采用形態(tài)鑒定法、同工酶譜法、SCAR-PCR法對棗莊市榴園鎮(zhèn)石榴園的根結(jié)線蟲種類進(jìn)行研究，結(jié)果表明，3種方法都鑒定其為南方根結(jié)線蟲。周銀麗等對危害云南石榴的根結(jié)線蟲種群鑒定為南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲。本研究中采集的樣本經(jīng)鑒定均為南方根結(jié)線蟲，在本地區(qū)是否有其他根結(jié)線蟲種危害石榴，仍需要在今后的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大采樣的范圍。