生鮮蔬菜消毒方法的比較

吳思　程妍　石健春　馮秋實　周穎　王小紅　李錦銓

摘要：利用大腸桿菌（Escherichia coli）構建生鮮蔬菜消毒過程中水污染模型和蔬菜污染模型，使用傳統消毒方法單獨處理被污染的水或蔬菜，分別比較其滅菌效率，并探究在傳統消毒方法的基礎上加入噬菌體進行輔助處理，分析其滅菌效率。結果表明，水污染模型中，0.004%硝酸銀的消毒效果最理想，滅菌率超過90%；6種不同殺菌方式對菠菜的殺菌效果最好，其次是生菜、香菜。蔬菜污染模型中，0.10%硝酸銀的消毒效果最理想，滅菌率超過85%，對生菜的殺菌效果最好，其次是香菜、菠菜。兩種不同的模型中，加入噬菌體M13K07輔助作用，均可以提高硝酸銀、次氯酸鈉和紫外照射單獨作用的滅菌率。

關鍵詞：生鮮蔬菜；消毒；大腸桿菌（Escherichia coli）；噬菌體

生鮮蔬菜是人體營養物質、維生素、膳食纖維的重要來源，在中國農業生產中占有重要地位。近年來，中國生鮮蔬菜生產、流通和銷售得到了長足發展，己經成為世界上第一大生鮮蔬菜生產國。蔬菜在生長過程中，因使用農藥和在摘取、包裝、運輸、銷售過程中的損壞，往往會被污染，其污染程度與蔬菜的表皮是否破損有關。表皮破損的蔬菜，細菌污染率較高，消毒不徹底易導致腸道傳染病的發生。如何消除蔬菜表面的病原菌，在保證生鮮蔬菜的食用安全性下最大限度地保持蔬菜的營養價值具有重要的現實意義。

凈菜也稱新鮮消毒蔬菜，即用新采摘的蔬菜，經過整理（去掉不可食部分、切分等）、洗滌、消毒等加工操作，在無菌環境中，真空包裝而制成的一種產品。凈菜在生產過程中，常使用的消毒方法是紫外照射和化學試劑處理，但是紫外線的滅菌作用只在其輻照期間有效，凈菜被處理后容易遭受二次污染。化學物質雖然可以達到持續消毒的目的，但在一些產業中，如水產養殖和食品工業等，不需要化學消毒劑的持續消毒。有研究報道，一些蔬菜經次氯酸鈉消毒處理后，有高濃度三氯甲烷生成，產生食品安全隱患。

噬菌體是一類感染其他病毒或細菌細胞的病毒總稱，其遺傳結構簡單，生命周期短，并且都以蛋白質外殼包裹的DNA或RNA為遺傳物質，可從污水等自然環境或者食品原料中提取到，其特異性強、自我增殖快，具有專一性、裂解性，即將成為新一代天然、綠色、安全抗菌制劑。近年來，有關于應用噬菌體制劑對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等各種細菌性感染治療的報道，其成功率均很高。美國食品和藥物管理局已經同意將噬菌體用于肉類食品的儲備。然而中國關于噬菌體的研究應用較少。

因此，本試驗構建生鮮蔬菜消毒過程中水污染模型和蔬菜污染模型，使用傳統消毒方法單獨處理被污染的水或蔬菜，分別比較滅菌效率，并探究在傳統方法的基礎上加入噬菌體進行輔助處理，比較其滅菌效率，以期為生鮮蔬菜消毒，減少由病原菌引發的食源性疾病提供參考依據。

1.材料與方法

1.1材料

試驗菌株為大腸桿菌地方分離菌株1、大腸桿菌地方分離菌株2、大腸桿菌噬菌體M13K07，購于北京寶科維食安生物技術有限公司。

1.2試劑與儀器

安琪胰蛋白胨、安琪酵母浸粉購自安琪酵母股份有限公司，瓊脂粉購自北京奧博星生物技術有限公司，NaCl等其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

紫外燈（254 nm，15 W，Philips TUVl5 W G15T8）、打孔器（直徑0.7 cm）、生物分光光度計（Eppendorf AG 22331 Hamburg）均購自艾本德中國有限公司。

1.3方法

1.3.1噬菌體生物學特性

1）噬菌體效價：取500ul對數期大腸桿菌菌液（OD為1.0），以及100ul噬菌體稀釋液（稀釋倍數為10^-6～10^-9），充分混勻，37℃120 r/min振蕩培養30 min。然后加入3 mL溶解好的42℃的2xYTTopAgar，振蕩均勻，立刻倒平板，37℃培養過夜，計算噬菌斑的數目。

噬菌體效價（PFU/mL）=噬菌斑數×稀釋倍數x10

2）噬菌體pH穩定性試驗：取EP管，分別加入不同pH（4、5、6、7、8、9、10）的2xYT培養基100μL，然后將EP管置于37℃恒溫水浴中：待溫度平衡后加入100μL的噬菌體稀釋液（10⁹PFU/mL），恒溫保存2 h。待作用時間結束后取樣，測定處理后的噬菌體效價。

3）噬菌體紫外耐受性試驗：取噬菌體稀釋液（10⁹PFU/mL）10mL于培養皿中，距離培養皿35 cm處，采用紫外燈照射，間隔15 min取樣，測定噬菌體效價，共取樣4次。

1.3.2消毒劑單獨作用對生鮮蔬菜的影響 取大腸桿菌菌液稀釋液（10⁴CFU/mL），分別進行如下處理：①1 mL菌液分別加入2、5、10μL濃度為2%的AgN03溶液，作用10 min；②1 mL菌液分別加入10、20、40μL濃度為5%的NaCl0溶液，作用10 min；③30 mL菌液置于培養皿中，距離培養皿35 cm處，采用紫外燈照射，間隔5 min取樣，取樣時間分別為0、5、10、15、20、25、30 min。然后分別加入生菜、菠菜和香菜各兩片，搖床（120 r/min，37℃）作用30 min后，取出葉片，研磨充分，加入500 μL2xYT培養基，取100μL涂平板計數。

1.3.3凈菜生產過程中處理被污染水的消毒方法取大腸桿菌菌液稀釋液（10⁴CFU/mL），對污水進行以下6種不同的消毒處理：①1mL菌液加入2μL2%AgNO₃作用10min；②1 mL菌液加入5μL噬菌體（10⁴PFU/mL）作用30 min，再加入2μL2%AgNO₃作用10min；③1mL菌液加入20μL 5%NaCl0作用10min；④1 mL菌液加入5μL噬菌體（10⁴PFU/mL）作用30min，再加入20μL 5%NaCl0作用10min；⑤取10 mL菌液，距離35 cm用紫外燈處照射，作用30min；⑥取10mL菌液，距離35 cm用紫外燈照射，作用30 min后，取1 mL菌液加入5μL噬菌體（104 PFU/mL）作用30 min。對照組不做任何處理。待作用時間結束后，每種處理方式分別加入生菜、菠菜、香菜，搖床（120 r/min，37℃）作用30 min后，取出葉片充分研磨，加入500μL2xYT培養基，取100μL涂平板計數。

1.3.4凈菜生產過程中處理被污染蔬菜的消毒方法 將一定數量的蔬菜葉片浸入大腸桿菌菌液稀釋液（10⁴CFU/mL）中，搖床120 r/min（37℃）作用30 min。之后分別取出被污染的生菜、菠菜、香菜葉片進行以下6種不同的消毒處理：①1 mL 2xYT培養基加入5 uL2%AgN03作用10min；②1 mL2xYT培養基加入5uL噬菌體（10⁴PFU/mL）作用30 min，再加入5uL2%AgNO₃作用10 min；③1 mL 2xYT培養基加入40 μL 5%NaCl0作用10 min；④1 mL2xYT培養基加入5μL噬菌體（10⁴PFU/mL）作用30 min，再加入40 μL 5%NaCl0作用10 min；⑤取生菜（4片）、菠菜（2片）、香菜（2片）距離紫外燈35 cm處照射，作用30 min；⑥取生菜（4片）、菠菜（2片）、香菜（2片）距離紫外燈35 cm處照射30 min后，取出葉片加入1 mL 2xYT培養基和5 μL噬菌體（10⁴PFU/mL）作用30 min。對照組不做任何處理。待作用時間結束后，取出葉片，研磨充分，加入500 μL2xYT培養基，取100 μL涂平板計數。滅菌率=（對照組菌落數-處理組菌落數）/對照組菌落數×100%。

1.4數據分析

采用GraphPad Prism5軟件分析數據并繪制圖表。

2.結果與分析

2.1噬菌體基本生物學特性

2.1.1噬菌體效價 噬菌體基本生物學特性如圖1所示，噬菌體效價如圖1A所示。由圖1A可知，空斑平均數為496個，菌落數計數平板的稀釋倍數為10^-9，故噬菌體效價為4.96×10¹²PFU/mL。

2.1.2噬菌體pH穩定性 噬菌體對于pH的穩定性結果如圖1B所示。由圖1B可知，噬菌體在pH為7-8時穩定性較好，在酸性及堿性條件下，其效價逐步下降：在pH小于5或大于10時，其效價下降明顯。

2.1.3噬菌體紫外耐受性 噬菌體的紫外耐受性試驗結果如圖1c所示。由圖1c可知，紫外照射60min使噬菌體的效價下降一個數量級，并且隨著照射時間的增加，噬菌體的效價逐步下降。因此，在后面的消毒方法中，先用紫外照射，然后加入噬菌體進行處理。

2.2不同消毒方法單獨作用對生鮮蔬菜的影響

2.2.1不同濃度的硝酸銀對生鮮蔬菜的影響 消毒劑單獨作用對生鮮蔬菜的影響如圖2所示，不同濃度的硝酸銀對生鮮蔬菜的處理結果如圖2A所示。由圖2A可知，硝酸銀濃度越高，滅菌效果越好：同一濃度的硝酸銀對于生菜的滅菌效果最為理想，菠菜次之，香菜最差。

2.2.2不同濃度的次氯酸鈉對生鮮蔬菜的影響不同濃度的次氯酸鈉對生鮮蔬菜的處理結果如圖2B所示。由圖2B可知，次氯酸鈉濃度越高，滅菌效果越好：0.20%次氯酸鈉對于香菜的滅菌效果最為理想，中、高濃度的次氯酸鈉對于生菜的滅菌效果較為理想。

2.2.3不同時間的紫外照射對生鮮蔬菜的影響不同時間的紫外照射對生鮮蔬菜的處理結果如圖2c所示。由圖2c可知，紫外照射時間越長，滅菌效果越理想。

2.3不同處理方法對被污染水及蔬菜的消毒效果比較

不同處理方式對被污染水及蔬菜消毒效果的比較如圖3所示。將被污染水進行6種不同方式的消毒處理，比較結果如圖3A所示。由圖3A可知，0.004%硝酸銀處理10 min和0.5%噬菌體消毒30min+0.004%硝酸銀消毒10 min的消毒效果較理想，滅菌率均超過90%：其次是0.10%次氯酸鈉消毒10 min和0.5%噬菌體消毒30 min+0.10%次氯酸消毒10 min，紫外燈處理的消毒效果相對較低，但滅菌率也超過80%。6種不同處理方式對菠菜的滅菌效果最理想，其次為生菜、香菜。另外，加入噬菌體M13K07輔助作用，可以適當提高硝酸銀、次氯酸鈉和紫外照射單獨作用的滅菌率，對3種生鮮蔬菜平均提高率分別為2.1、1.9、1.7個百分點。

2.4不同的處理方法對被污染蔬菜消毒效果的比較

將被污染蔬菜進行6種不同方式的消毒處理，比較結果如圖3B。由圖3B可知，0.10%硝酸銀處理10 min和0.5%噬菌體消毒30 min+0.010%硝酸銀消毒10 min的消毒效果較理想，滅菌率超過85%：其次是0.20%次氯酸鈉消毒10 min和0.5%噬菌體消毒30 min+0.20%次氯酸消毒10 min，滅菌率也超過85%，紫外燈處理的消毒效果相對較低，滅菌率超過80%。6種不同處理方式對生菜的滅菌效果最理想，其次為香菜、菠菜。另外，加入噬菌體M13K07可起到輔助作用，可以提高硝酸銀、次氯酸鈉和紫外照射單獨作用的滅菌率，分別提高2.4、2.3、2.9個百分點。

3.小結與討論

本試驗分析了噬菌體的基本生物學特性，并利用大腸桿菌構建生鮮蔬菜消毒過程中水污染模型和蔬菜污染模型，使用傳統消毒方法單獨處理被污染的水或蔬菜，分別比較其滅菌率，并探究在傳統消毒方法的基礎上加入噬菌體進行輔助處理，能否提高其滅菌效率。結果表明，水污染模型中，0.004%硝酸銀處理10 min的消毒效果最理想，滅菌率超過90%：6種不同處理方式對于菠菜的滅菌效果最理想，依次為生菜、香菜。蔬菜污染模型中，0.10%硝酸銀處理10 min的消毒效果最理想，滅菌率超過85%：6種不同處理方式對于生菜的滅菌效果最理想，依次為香菜、菠菜。另外，兩種不同的模型中，加入噬菌體M13K07可以提高硝酸銀、次氯酸鈉和紫外照射滅菌率約2個百分點，并且蔬菜污染模型中提高的幅度略高于水污染模型。

大腸桿菌對凈菜生產過程以及廣大消費者均存在不可忽視的潛在威脅，因此，應當建立完善的消毒體系。在凈菜生產過程中，可以選用0.004%硝酸銀處理10 min，并加入0.5%噬菌體處理30 min，滅菌效果最為理想。同時，可以將0.10%硝酸銀與0.5%噬菌體制成混合噴霧劑，用于家庭式對生鮮蔬菜的消毒。