中國西門塔爾太行類群牛肉質(zhì)性狀與SLC27A1基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)分析

張喜忠　王曦　張元慶　楊效民　王棟才　靳光　李博　徐芳　程景

摘要：為探索SLC27A1基因?qū)εＨ赓|(zhì)性狀的影響，選取中國西門塔爾牛太行類群牛公牛、閹牛各20頭為研究對象，采用PCR法分析SLC27A1的基因遺傳多態(tài)性。檢測到SNP位點為S5650：T>C，該位點存在有3種基因型，其中CC基因型頻率較高（62.5%），TT基因型頻率最低（12.5%）。采用GLM對內(nèi)質(zhì)相關(guān)性狀與SLC27A1基因進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，剪切力、肉色a、肉色b表型中，CC與TT及CT與丌差異均極顯著（P<0.01），其他性狀間差異不顯著（P>0.05），閹牛與公牛間對肉質(zhì)的彈性與咀嚼性差異顯著（P<0.05）。采用Real-time PCR分析，CC基因型在肌肉與脂肪中的表達量比基因型CT與TT差異顯著（P<0.05），閹牛與公牛之間的表達量在肌肉中差異極顯著（P<0.01）。SLC27A1基因S5650：T>C位點突變對中國西門塔爾牛太行類群肉質(zhì)性狀存在一定的遺傳效應(yīng)，

關(guān)鍵詞：SLC27A1基因；肉質(zhì)性狀；SNP；中國西門塔爾太行類群

SLC27A1（S0lute carrier family 27 member 1），又稱作FATP（Fatty acid transpon pmteins），是脂肪酸運輸?shù)鞍准易宄蓡T，具有調(diào)節(jié)長鏈脂肪酸在機體局部和全身系統(tǒng)中新陳代謝的作用。提純的SLC27A1具有類似乙酰輔酶A的活性，并通過催化機體內(nèi)雙層分子膜中的脂肪酸不斷轉(zhuǎn)化成脂肪酸乙酰輔酶A來加快脂肪酸的吸收。通過組織中SLC27A1的活化作用，可以促使胰島素調(diào)控長鏈脂肪酸的攝入，且SLC27A1具有分配脂肪酸到機體各組織中的作用。SLC27A1基因敲除小鼠脂肪組織中的脂滴半徑小于正常小鼠，且在低溫環(huán)境下維持體溫恒定的能力很差，這說明SLC27A1在運送長鏈脂肪酸通過質(zhì)膜維持能量平衡、產(chǎn)生熱量等生理過程中起著至關(guān)重要的作用，是脂肪代謝的重要調(diào)節(jié)因子。SLC27A1基因失活的小鼠可免受食源性肥胖的困擾。

Ordovas等為獲得牛的SLC27A1的DNA片段，利用人類該基因的mRNA序列擴增了一段505bp牛的該基因片段并掃描了牛的BAC文庫，得到了包含SLC27A1的BAC克隆，并將SLC27A1基因定位于染色體7q11-q12上，該基因有12個外顯子，編碼646個氨基酸，近年來已在7號染色體上發(fā)現(xiàn)了一些與脂肪代謝相關(guān)聯(lián)的性狀位點（QTL）。

本研究利用PCR測序技術(shù)針對西門塔爾太行類群雜交牛的SLC27A1基因進行擴增，采用測序技術(shù)進行基因型檢測，將不同基因型與脂肪相關(guān)性狀進行關(guān)聯(lián)分析，以期找到與產(chǎn)奶性狀相關(guān)的分子標記，以期為標記輔助選擇在提高肉質(zhì)性能上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物與屠宰檢測 迅速取剛屠宰后的中國西門塔爾太行類群牛公牛、閹牛各20頭，每頭牛血3 mL，2mLACD抗凝，保溫箱中帶回，用于提取基因組DNA。取眼肌部位10 cm3肉送檢。取眼肌肉與皮下脂肪各0.5 g，放入液氮冷凍后置于-80℃保存。

1.1.2引物 SLC27A1基因比較保守，不同物種間編碼區(qū)差異較小，所以使用小鼠同源序列設(shè)計SLC27A1引物，其擴增片段信息及B-actin基因引物如表1所示，B-actin基因引物根據(jù)文獻獲得。

1.2SLC27A1基因型檢測

1.2.1PCR擴增 PCR反應(yīng)體系：在100uLEP管中加入10×PCR緩沖液2.0uL、2.5 mmol/L dNTP1.6uL、Tag DNA聚合酶1 U/uL、上下游引物各30ng、基因組DNA約100 ng、加去離子水至總反應(yīng)體積20uL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min，35個循環(huán)（94℃變性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸90 s），72℃延伸10 min，4℃保存。取2uLPCR產(chǎn)物與0，5uL溴酚藍緩沖液混勻，0.8%瓊脂糖凝膠，110 v電泳0.5 h后，紫外燈下觀察有無擴增產(chǎn)物。

1.2.2PCR產(chǎn)物的回收測序 PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，將回收得到的PCR產(chǎn)物與pMDl9T-vector連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，搖菌，菌液送北京奧科生物有限公司進行測序，檢測樣品的SNP基因型。

1.3定量的方法及標準曲線的制作

1.3.1牛皮下脂肪RNA的提取 按照QIAGEN脂肪RNA提取試劑盒說明書步驟進行，采用Trizol一步法提取牛皮下脂肪與肌肉中總RNA。

1.3.2標準陽性質(zhì)粒的制備、標準曲線的建立及定量PCR 將制備的陽性標準品質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，取1010至1038個稀釋度作為標準模板，同時設(shè)陰性對照。PCR反應(yīng)體系為：SYBR Green Master Mix 7.5uL，上游引物0.3uL，下游引物0.3uL，組織cDNA或B-actin質(zhì)粒模板1.0uL，加無菌水至15uL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。溶解曲線反應(yīng)：55℃30 s：每30 s提高0.5℃至95℃，共81個循環(huán)。為了保證每個組織目的基因相對表達的可重復(fù)性，消除因加樣造成的誤差，每個樣品的檢測設(shè)3個重復(fù)。Real-time PCR的產(chǎn)物特異性通過凝膠電泳結(jié)合溶解曲線分析加以驗證。

1.4統(tǒng)計分析

1.4.1SLC27A1基因多態(tài)性分析 根據(jù)測序結(jié)果，得出SLC27A1基因不同基因型，然后計算基因頻率與基因型頻率。

3.討論

3.1SLC27A1基因多態(tài)性及群體遺傳特性分析

本研究以牛的SLC27A1基因作為影響肉牛肉質(zhì)性狀的候選基因，借助PCR測序技術(shù)對部分SLC27A1基因進行了檢測，檢測得到1個SNP位點S5650：T>C，可能由于樣品少的原因，TT型頻率較低，不能反映整個牛群的遺傳結(jié)構(gòu)，但也可能因為中國西門塔爾太行類群牛在品種形成過程中，親本祖先地域與親緣關(guān)系上較遠，經(jīng)過3～4代的結(jié)合，還沒有實現(xiàn)遺傳上的哈一溫平衡，造成基因頻率與基因型頻率的特異性。

3.2SLC27A1基因與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析

閹與否對肉質(zhì)的彈性與咀嚼性差異顯著，也能說明，閹牛對肉質(zhì)性狀的影響，閹牛的肉質(zhì)更具有彈性與可咀嚼性。基因型與表型差異不顯著，可能是反映真實的一種情況，但也有可能是由于樣本量少，樣品的檢測結(jié)果存在較大的方差，使得統(tǒng)計差異不顯著。基因型與表達量的方差分析表明，CC型表達差異顯著，可能CC基因型影響SLC27A1基因在肌肉與脂肪中的表達，表達量的變化可能會影響脂肪在肌肉組織與脂肪組織中的沉積。wsng等發(fā)現(xiàn)SLC27A1基因表達部位與年齡存在一定關(guān)系，說明SLC27A1基因在不同時期在不同雞組織部位影響脂肪的代謝，但是在肉質(zhì)檢測的表型統(tǒng)計中差異不顯著，這可能與采樣及樣本的數(shù)量有一定關(guān)系，還需進一步研究。

因為SLC27A1基因與脂肪的作用有關(guān)，Ordovds等于2005將SLC27A1基因定位于牛的第7號染色體上，2008年在荷斯坦與西班牙兩個牛品種Asturiana de los Valles和MenorUuina中發(fā)現(xiàn)SLC27A1基因不會影響乳脂含量。呂延飛等對SLC27A1基因SNPs與中國荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀進行關(guān)聯(lián)分析，首次在3UTR發(fā)現(xiàn)了G64A位點，exon3的T112c位點的c等位基因?qū)Ξa(chǎn)奶量起到正效應(yīng)，通過提高cc基因型頻率有望提高中國荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶量。由此推斷，SLC27A1基因可作為影響中國荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量的候選基因，進行更深入的研究。Lv等、Ordovas等將SLC27A1作為候選基因，在中國荷斯坦奶牛中研究發(fā)現(xiàn)兩個SNP位點，其中等位基因C與奶牛的產(chǎn)奶性狀有關(guān)，CC基因型產(chǎn)奶量差異顯著。zhang等在安格斯與和牛雜交一代中研究30個復(fù)合表型，發(fā)現(xiàn)SLC27A1基因影響肉中油酸Oleic acid含量（P=0.0155），從而影響肉的風味與肉質(zhì)。

針對SLC27A1基因在中國西門塔爾牛太行類群的群體分析，檢測到一個SNP位點S5650：T>C，同時檢測到基因型為CC、CT與TT。統(tǒng)計結(jié)果表明，剪切力表型中CC與TT差異極顯著（P>0.01），肉色a、肉色b表型中，CC與TT、CT與TT差異均極顯著（P<0.01）。閹與否對肉質(zhì)的彈性與咀嚼性差異顯著（P<0.05），與肉樣品的pH、硬度1、硬度2、內(nèi)聚性、膠粘性等表型值的相關(guān)分析，結(jié)果表明差異不顯著（P<0.05），需擴大樣本繼續(xù)研究。從總的表型與基因型分析看，CC型對應(yīng)的肉質(zhì)性狀表現(xiàn)為肉色值低、剪切力高、熟肉率高、彈性強等特點。

3.3熒光定量

由于SLC27A1基因功能的特殊性，不同組織和器官中其表達量不同，在一些快速代謝脂肪酸的組織器官，如心臟、肌肉、脂肪組織中表達量最高。轉(zhuǎn)基因鼠心臟過度表達SLC27A1會引起心肌炎。而SLC27A1基因的表達量中，不同基因型之間在肌肉與脂肪中的表達量差異顯著（P<0.05）。該基因在閹牛肌肉中的表達量存在極顯著差異，可能會影響到牛肉的肉質(zhì)性狀。是否可以用于分子選育，還需進一步的研究，

4.小結(jié)

本研究采用基因SNP位點檢測方法，對40頭牛個體的SLC27A1基因部分區(qū)段進行遺傳變異檢測，采用GLM模型分析SLC27A1基因S5650：T>C位點突變對中國西門塔爾牛太行類群的部分屠宰與肉質(zhì)性狀的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該位點基因型及等位基因頻率分布在群體間表現(xiàn)出較大的差異性，SLC27A1基因S5650：T>C位點突變對中國西門塔爾牛太行類群部分肉質(zhì)性狀有較大的遺傳效應(yīng)，可進行進一步驗證，用于肉牛品種培育過程中標記輔助選擇，也可作為改善牛肉質(zhì)量的重要候選基因，但有關(guān)該位點遺傳效應(yīng)差異、影響的分子機制及突變對動物體脂肪合成的生理生化作用方面值得進一步深入研究。