HPLC法測(cè)定60℃烘烤前后滇重樓藥材四種皂苷的含量變化

杜春華 徐怡 李東嫻 曹紅云 秦波 游燕

摘要：目的分析測(cè)定經(jīng)過(guò)60℃烘烤前后滇重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量變化。方法采用HPLC法，色譜柱為WatersSunFire-C18（4.6 mm×150 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水為流動(dòng)相，梯度洗脫；進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。結(jié)果8個(gè)不同產(chǎn)地的滇重樓藥材，經(jīng)過(guò)60℃烘烤前后滇重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量變化有差異，其中四種皂苷總量及重樓皂苷Ⅰ含量明顯降低。結(jié)論經(jīng)過(guò)60℃烘烤后對(duì)滇重樓的品質(zhì)有影響。

關(guān)鍵詞：滇重樓；重樓皂苷；含量變化；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2016）05-0049-03

重樓首載于《滇南本草》，為重樓屬植物，學(xué)名為[Paris polyphylla var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.]，現(xiàn)稱滇重樓。在云南的別名為土三七、七葉一枝花、重樓、大重樓、重臺(tái)、兩把傘、獨(dú)角蓮（滇南本草），根莖入藥，有消腫解毒，止血止痛，利小便之功能[1-2]。滇重樓是中成藥，如云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧膠囊、樓蓮膠囊、熱毒清膠囊等的主要原料之一[3]-4]。甾體皂苷是重樓的主要活性成分，并含有氨基酸、甾酮、蛻皮激素、黃酮苷等化合物，具有止血、抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜等作用。甾體皂苷：按苷元的不同主要有兩類，一類為薯蕷皂苷元（diosgenin）的糖苷，另一類為偏諾皂苷元（pennogenin）的糖苷，重樓皂苷中屬于薯蕷皂苷元的有重樓皂苷I、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ，屬于偏諾皂苷元的有重樓皂苷Ⅶ[3，5]。現(xiàn)采用HPLC測(cè)定經(jīng)過(guò)60℃烘烤不同產(chǎn)地的滇重樓藥材中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量變化，為評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量、臨床藥理研究及產(chǎn)地加工提供理論參考。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器和試藥

1.1.1儀器Waters e2695高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國(guó)Waters）、AG285型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）、DHG-9031A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.1.2試劑重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為：111590-200402，111591-201103，111592-201203，111593-200402）；乙腈為色譜純（德國(guó)默克公司），甲醇為分析純，水為超純水。

1.1.3藥材采集8個(gè)不同產(chǎn)地滇重樓藥材，均為栽培品種，產(chǎn)地分別為：大理九頂山、新平縣嘎灑鎮(zhèn)、云龍縣白石鎮(zhèn)、云龍縣關(guān)坪鄉(xiāng)、耿馬縣大興鄉(xiāng)、蒙自冷泉鎮(zhèn)、馬關(guān)縣南撈鄉(xiāng)、祿勸縣撒營(yíng)盤鄉(xiāng)（見(jiàn)表1），經(jīng)云南省藥物所究所天然藥物資源研究中心高級(jí)工程師戚育芳鑒定為為百合科植物云南重樓[P.polyphylla var.yunnanensis（Fr.）Hand.-Mazz.]的干燥根莖。

1.2方法與結(jié)果

1.2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性色譜柱為（WatersSunFire-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（流動(dòng)相A 0→40 min，30%→70%；40→50 min，60%→40%），流速：1.0 min·mL-1，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。在此色譜條件下，理論板數(shù)按重樓皂苷Ⅰ峰計(jì)算不低于4000。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成濃度為0.4110、0.3950、0.4300、0.4380 mg/mL的溶液，即得對(duì)照品混合溶液。

1.2.3樣品的制備將清洗前后各8個(gè)不同產(chǎn)地的滇重樓藥材，每一批號(hào)的樣品先用鐵錘敲小平均分為2份，一份直接用萬(wàn)能粉碎機(jī)打粉，過(guò)3號(hào)篩；另一份用自來(lái)水清洗3遍，裝于鐵絲網(wǎng)篩中濾干水分后放入電熱恒溫干燥箱中，60℃恒溫干燥24 h，放冷后用萬(wàn)能粉碎機(jī)打粉，過(guò)三號(hào)篩備用，同時(shí)測(cè)定水分含量。取約0.5 g 重樓藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品混合溶液2、5、10、15、20、25、30 μL分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的回歸方程分別為：YⅠ=145362XⅠ+20908（r=0.9995）；YⅡ=280662XⅡ-15056（r=0.9993）；YⅥ=370123XⅥ+10054（r=0.9996）；YⅦ=254145XⅦ+13908（r=0.9995）。線性范圍分別為2.1222～12.1000、2.1014～13.7500、1.6455～14.5000、1.8805～12.6600 μg。

1.2.5儀器精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品混合溶液10μl，按“1.2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣5次，各成分峰面積的RSD分別為0.98%、1.17%、1.02%、0.88%。表明該方法儀器精密度良好。

1.2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一產(chǎn)地的樣品5 份，按“1.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)條件，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量。其含量的RSD分別為1.78、2.00、1.65、2.12%。表明方法重復(fù)性良好。

1.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算各成分峰面積的RSD分別為1.98、2.36、2.07、2.14%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.8回收率試驗(yàn)取已知含量的同一供試品6份，每份0.5 g，精密稱定，分別添加對(duì)照品貯備液1 mL（重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ分別為0.1058 mg.m l-1、0.0625 mg.m l-1、0.0682 mg.m l-1、0.0578 mg.m l-1），按“1.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液。按“1.2.1”項(xiàng)條件，分別精密進(jìn)樣10μl，測(cè)得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的平均回收率分別為97.55、96.06、98.08、98.20%；RSD分別為2.88、2.65、2.58、2.76%。表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

1.2.9樣品的測(cè)定精密稱取8個(gè)不同產(chǎn)地滇重樓藥材粉末各2份，每份約0.5 g。按1.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)條件進(jìn)樣，測(cè)得各色譜峰的峰面積。按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量（見(jiàn)表1）。對(duì)照品及樣品圖譜（見(jiàn)圖1）。結(jié)果表明，8個(gè)不同產(chǎn)地的滇重樓藥材，經(jīng)過(guò)60℃烘烤前后滇重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量變化有差異，其中四種皂苷總量及重樓皂苷Ⅰ含量明顯降低。重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ的變化無(wú)明顯規(guī)律。

2討論

滇重樓化學(xué)成分復(fù)雜，對(duì)滇重樓有效成分的藥理研究表明其藥理活性強(qiáng)，如：重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ具有細(xì)胞毒活性、重樓皂苷Ⅰ～Ⅲ具有免疫調(diào)節(jié)活性，偏諾皂苷的止血活性強(qiáng)于薯蕷皂苷[6]。《中國(guó)藥典》2015年版一部規(guī)定按干燥品計(jì)算，重樓皂苷Ⅰ（C44H70O16），重樓皂苷Ⅱ（C51H82O20），重樓皂苷Ⅵ（C39H62O13）和重樓皂苷（C51H82O21）的總量作為重樓含量測(cè)定的指標(biāo)成分，且不得少于0.60%[7]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8個(gè)不同產(chǎn)地樣品清洗后經(jīng)過(guò)60℃烘烤后重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ總量及重樓皂苷Ⅰ的含量有明顯的降低，有效成分的藥理活性是否也會(huì)相應(yīng)的降低，還有待進(jìn)一步的藥理研究。在滇重樓干燥過(guò)程中，伴隨著滇重樓內(nèi)水分的散失，其生理活性和物理形態(tài)也發(fā)生著顯著的變化，不同干燥方法對(duì)滇重樓的品質(zhì)影響較大[8]。《中國(guó)藥典》2015年版一部規(guī)定藥材產(chǎn)地加工及炮制的干燥方法中低溫干燥（一般不超過(guò)60℃）。滇重樓經(jīng)過(guò)60℃烘烤24 h后，確實(shí)對(duì)其品質(zhì)有影響。

近年來(lái)，隨著國(guó)家對(duì)天然藥物生產(chǎn)制劑和原料進(jìn)行控制和管理，從天然藥物的源頭抓起，以保證藥材質(zhì)量的穩(wěn)定，那么對(duì)滇重樓選取適宜的干燥方法和干燥溫度還有待進(jìn)一步摸索研究，從而保證其作為中成藥的原料藥的品質(zhì)奠定基礎(chǔ)，也為滇重樓產(chǎn)地采收加工提供理論依據(jù)。

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