刺五加葉純化物對2型糖尿病大鼠降血糖、降血脂作用的實(shí)驗(yàn)研究

翟春梅　孟永海　王欣慰

【摘要】 目的：探索刺五加葉純化物對2型糖尿病大鼠血糖、血脂的作用及其治病機(jī)理。方法：通過高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的方法建立2型糖尿病大鼠動物模型，給予模型大鼠不同藥物及劑量，觀察刺五加葉純化物對模型大鼠血糖、血脂及抗氧化機(jī)制的影響。結(jié)果：刺五加乙醇提取物組，刺五加葉純化物高、中劑量組及陽性藥物組FBG均低于模型對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。刺五加乙醇提取物組，刺五加葉純化物高、中劑量組及陽性藥物組TG及CHO含量均低于模型對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。模型對照組各時(shí)間點(diǎn)FBG均高于正常對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；刺五加葉乙醇提取物組，刺五加葉純化物高、中、低劑量組及陽性藥物組各時(shí)間點(diǎn)FBG均低于模型對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。模型對照組SOD含量明顯低于正常對照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；刺五加乙醇提取物組，刺五加葉純化物高、中、低劑量組及陽性藥物組SOD含量均高于模型對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型對照組MDA含量明顯高于正常對照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；刺五加乙醇提取物組，刺五加葉純化物高、中、低劑量組及陽性藥物組MDA含量均低于模型對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：刺五加葉純化物及乙醇提取物具有降低模型大鼠的空腹血糖，降血脂功能，可明顯增強(qiáng)自由基清除能力和降低ROS的產(chǎn)生，起到抗氧化應(yīng)激、防止氧化損傷的效果，最終達(dá)到抗糖尿病、改善胰島素抵抗的作用。刺五加葉純化物比乙醇提取物和參芪降糖膠囊具有更加優(yōu)越的治療2型糖尿病的作用，并呈現(xiàn)劑量正相關(guān)。有望開發(fā)成為新一代的降血糖藥物。

【關(guān)鍵詞】 刺五加葉純化物； 2型糖尿病； 血糖； 血脂

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.006

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，為一種終身性疾病。2015年國際糖尿病聯(lián)合會（IDF）公布的新數(shù)據(jù)[1]：（1）2015年糖尿病醫(yī)療保健支出總額為6730億美元。（2）全球有4.15億糖尿病成年患者，3.18億人存在患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，全球三分之一的糖尿病人來自中國，成年人群中糖尿病前期（IGT）患病率為50.1%。其中2型糖尿病（T2DM）的發(fā)病率約占總發(fā)病率的90%以上，危害程度最大，可導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害及功能障礙[2]。因此，如何預(yù)防和治療T2DM及其并發(fā)癥已成為世界各國藥學(xué)研究者面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)和艱巨任務(wù)。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的方法建立2型糖尿病大鼠動物模型，考察刺五加葉純化物對模型大鼠血糖、血脂及抗氧化機(jī)制的影響，測定相關(guān)生理生化指標(biāo)，為探討其治病機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和指導(dǎo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 刺五加葉純化物實(shí)驗(yàn)室自制，參芪降糖膠囊（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z10980085，河南羚銳制藥股份有限公司），鏈脲佐菌素STZ（批號：110610，美國Sigma公司），血糖試紙（批號：470713，德國羅氏診斷有限公司），10%水合氯酸（批號：20131021，上海國藥集團(tuán)）。總膽固醇測定試劑盒（CHO，南京建成生物公司，批號：20150430），甘油三脂測定試劑盒（TG，南京建成生物公司，批號：20150601），超氧化物歧化酶SOD試劑盒（批號：201503136，南京建成生物公司），丙二醛MDA測定試劑盒（批號：20150514，南京建成生物公司），其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠，雄性，180～220 g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SCXK黑2008-0002。

1.1.3 飼料 基礎(chǔ)詞料（SPF級）：玉米、小麥、豆粉、進(jìn)口魚粉等。高糖高脂飼料（SPF級）：膽固醇1%，蔗糖10%，蛋黃粉10%，豆油3%，基礎(chǔ)飼料66%，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)安全評價(jià)動物中心。

1.1.4 主要儀器 7150型全自動生化分析儀（日本日立公司），羅氏血糖儀（德國羅氏診斷有限公司），可見分光光度計(jì)（THERMO，US），離心機(jī)（THERMO，US），Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用刺五加葉純化物的制備 取刺五加葉2.0 kg粉碎，加10倍重量的70%乙醇回流提取2次，每次提取2 h，將濾液濃縮至密度為1.18 g/mL后加入濃度為水至乙醇終濃度為40%，靜置12 h，離心，得上清液。上清液減壓回收乙醇后加入一定量水分散至8 L后上DM-301型大孔吸附樹脂柱，大孔吸附樹脂用量為4 kg，收集水洗脫液重量為10 kg，用濃度為90%的乙醇8 kg進(jìn)行洗脫，減壓回收90%乙醇洗脫液，得刺五加葉治療2型糖尿病提取物136 g。

1.2.2 2型糖尿病模型的建立 實(shí)驗(yàn)用SD大鼠于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)條件下適應(yīng)1周，期間自由進(jìn)食、自由飲水。正常對照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。其余大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，禁食不禁水12 h，按30 mg/kg劑量一次性腹腔注射2%STZ工作液（4 ℃預(yù)冷的0.1 mM桿檬酸緩沖液新鮮配制，避光，pH4.5）。正常對照組則注射相應(yīng)劑量的檸檬酸緩沖液。注射3 d后，禁食12 h尾靜脈取血測空腹血糖，以FBG>7.8 mmol/L為成功建立2型糖尿病模型的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 分組與給藥 正常對照組SD大鼠（雄性，180～220g）10只，按標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)選取，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料；將造模成功的2型糖尿病大鼠隨機(jī)分為6個(gè)組：模型對照組，陽性藥物組（參芪降糖膠囊），刺五加葉乙醇提取物組，刺五加葉純化物高劑量組（800 mg/kg），刺五加葉純化物中劑量組（400 mg/kg），刺五加葉純化物低劑量組（200 mg/kg），每組10只。正常對照組和模型對照組給予等量蒸餾水，其余各藥物干預(yù)組分別灌胃給予刺五加葉純化物及各提取成分。每天給藥1次，連續(xù)給藥6周。實(shí)驗(yàn)動物在處死前禁食12 h，麻醉后腹主動脈取血，離心，血清樣本分裝于1.5 mL離心管內(nèi)，存放溫度-80 ℃。腎臟、胰腺、肝臟、脂肪和肌肉等組織被迅速的分離，收集和儲存于-80 ℃環(huán)境中，備用。按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行FBG、TG、CHO等相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2.4 主要檢測方法 （1）空腹血糖（FBG）的測定及葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）。在整個(gè)6周的實(shí)驗(yàn)室周期內(nèi)，每周尾靜脈取血測量1次，采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖，具體操作方法詳見說明書。末次給藥后，大鼠禁食不禁水過夜，次日以40%葡萄糖溶液2.5 g/kg灌胃，分別尾靜脈采血測定大鼠在空腹及灌胃后0、30、60、90、120 min時(shí)的血糖水平。（2）血清甘油三酯（TG）、血清總膽固醇（CHO）、肝組織丙二酸（MDA）、肝組織超氧化物歧化酵（SOD）的含量測定。IPGTT測試完成24 h后，大鼠被處死，腹主動脈取血，釆用全自動生化分析儀檢測，照商品化試劑盒的說明書對各組動物的TG、CHO、MDA、SOD含量進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 正常對照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中狀態(tài)良好，毛色光滑，大小便正常，進(jìn)食量正常；模型對照組大鼠排尿量顯著增加，毛色枯黃粗糙，并容易脫毛，進(jìn)食量、飲水量大且反應(yīng)遲鈍，各藥物治療組有不同程度改善；模型對照組體形較瘦，其他給藥組體重仍有增加，但正常對照組大鼠體重明顯增重。

2.2 各組FBG、TG及CHO比較 刺五加乙醇提取物組，刺五加葉純化物高、中劑量組及陽性藥物組FBG均低于模型對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；除正常對照組外，刺五加葉純化物高劑量組FBG最低。刺五加乙醇提取物組，刺五加葉純化物高、中劑量組及陽性藥物組TG及CHO含量均低于模型對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；除正常對照組外，刺五加葉純化物高劑量組TG及CHO含量最低，見表1。

2.3 各組IPGTT結(jié)果比較 模型對照組各時(shí)間點(diǎn)FBG均高于正常對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且模型對照組FBG降低緩慢，正常對照組大鼠在120 min后FBG基本趨于正常；刺五加葉乙醇提取物組，刺五加葉純化物高、中、低劑量組及陽性藥物組各時(shí)間點(diǎn)FBG均低于模型對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2。

2.4 各組SOD及MDA含量比較 模型對照組SOD含量明顯低于正常對照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；刺五加乙醇提取物組，刺五加葉純化物高、中、低劑量組及陽性藥物組SOD含量均高于模型對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；除正常對照組外，刺五加葉純化物高劑量組SOD含量最高。模型對照組MDA含量明顯高于正常對照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；刺五加乙醇提取物組，刺五加葉純化物高、中、低劑量組及陽性藥物組MDA含量均低于模型對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；除正常對照組外，刺五加葉純化物高劑量組MDA含量最低，見表3。

3 討論

糖尿病致病機(jī)理尚不完全明確，主要由遺傳因素和環(huán)境因素共同引起，主要病理生理特征是在肝臟、骨骼肌和脂肪組織中的胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷，這些病理生理異常將導(dǎo)致葡萄糖代謝失衡，血糖升高[2]。隨著人們對糖尿病病因和病理的深入了解，以及糖尿病相關(guān)的藥理靶點(diǎn)的不斷發(fā)掘，現(xiàn)已針對糖尿病不同的作用機(jī)理開發(fā)出多種降糖藥物，并已在臨床中使用，主要有三大類化學(xué)藥物用于T2DM的治療[3]。（1）促進(jìn)胰島素分泌的藥物；（2）胰島素增敏藥物；（3）影響糖吸收的藥物。目前臨床常用的T2DM治療藥物仍以合成的化學(xué)藥物為主，但均存在明顯不良反應(yīng)。（1）促進(jìn)胰島素分泌的藥物主要有磺脲類、非磺脲類。磺脲類藥物與胰島β細(xì)胞膜上的磺脲受體特異性結(jié)合，是非肥胖的T2DM患者的一線治療藥物，但是所有的磺脲類藥物均能引起低血糖，還可引起胃腸道和血液系統(tǒng)的不良反應(yīng)[4]。非磺脲類藥物與胰島β細(xì)胞膜上依賴ATP的K+通道上的36 kDa蛋白特異性結(jié)合，同樣也會產(chǎn)生胃腸道和心血管等不良反應(yīng)[4]。（2）胰島素增敏類藥物臨床常用噻唑烷二酮類（馬來酸羅格列酮、鹽酸吡格列酮），作用靶點(diǎn)是過氧化物酶體增生物激活的γ-型受體（PPARγ），同樣會產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，限制了其在臨床上的應(yīng)用。（3）影響糖吸收的藥物主要有雙胍類（鹽酸二甲雙胍）和α-葡萄糖苷酶抑制劑（阿卡波糖、伏格列波糖）。雙胍類藥物已報(bào)道有氨基轉(zhuǎn)移酶升高反應(yīng)，也有右上腹疼痛、尿色變深、糞便顏色變淡、皮膚黃染等表現(xiàn)，甚至出現(xiàn)肝壞死[4]。當(dāng)代的西醫(yī)藥治療糖尿病取得了很好的療效，但顯然西醫(yī)藥方法未能從根本上預(yù)防、改善和徹底治療糖尿病及其其并發(fā)癥。

中國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)治療消渴癥（糖尿病）歷史悠久而常有奇效，始見于《黃帝內(nèi)經(jīng)·奇病論》，名為消渴。中醫(yī)常以“三消”分證論治，“上消”清熱潤肺、生津止渴，常以“麥門冬湯”療之；“中消”清肺瀉火、養(yǎng)陰增液，常以“白虎加人參湯”療之；“下消”滋陰補(bǔ)腎、生津止渴，常以“六味地黃丸”療之。若以“氣血陰陽”分證論治，又可分為“陰虛燥熱”、“氣陰兩虛”、“陰陽兩虛”、“瘀血內(nèi)阻”等證型，分有不同藥方對癥施治。常用于治療消渴癥的中藥達(dá)百余種，還有大量的民間藥膳療法。中藥及天然藥物以其毒副作用小、作用溫和持久、具有綜合治療作用、可延緩并發(fā)癥等優(yōu)點(diǎn)，受到醫(yī)藥學(xué)界越來越多的關(guān)注。近年來對中藥降糖成分的篩選及作用機(jī)理的研究進(jìn)展迅速，目前發(fā)現(xiàn)具有降血糖作用的成分主要有多糖、皂苷、萜類、黃酮、生物堿、多肽和氨基酸等[5]。在此背景下，從中藥及天然植物中篩選、發(fā)現(xiàn)安全有效的新型抗糖尿病藥物，以滿足臨床個(gè)性化治療方案及藥物多樣化的需求，已成為治療糖尿病藥物研究的必然發(fā)展趨勢。

中藥“刺五加”（根莖）始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，自古即被視為具有添精補(bǔ)髓及抗衰老作用的良藥，主要用于治療風(fēng)濕痹痛、腰膝酸痛及水腫、小便不利等證。現(xiàn)代研究具有抗疲勞、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗癌、抗糖尿病、抗心律失常、免疫增強(qiáng)和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用。然而，由于刺五加食用藥用價(jià)值均高，長期以來一直被掠奪式的采挖，致使野生資源遭到了嚴(yán)重破壞，現(xiàn)已呈零星分布，1992年中國植物紅皮書已將刺五加列入漸危物種。

對于刺五加降血糖研究發(fā)現(xiàn)其主要成分eleutheroside E、syringin及多糖具有很強(qiáng)的降血糖活性[6-8]。而這些活性成分也是刺五加葉的主要成分[9]。刺五加葉中含有大量的皂苷類、黃酮類和酚酸類成分，與刺五加根莖中的成分存在很多類似[10]。我國學(xué)者對刺五加葉總皂苷組分治療糖尿病的藥理學(xué)進(jìn)行了研究[11-17]。然而，以往對刺五加葉研究并未對其化學(xué)成分、藥效和作用機(jī)理進(jìn)行相關(guān)性研究，尚未能研制出治療糖尿病的新中藥制劑或新中藥資源，還未能對臨床產(chǎn)生指導(dǎo)性作用。

本研究結(jié)果表明，與模型組對照組比較，刺五加葉純化物及乙醇提取物具有降低模型大鼠血糖及血脂的功能，可明顯增強(qiáng)自由基清除能力，降低ROS的產(chǎn)生，起到抗氧化應(yīng)激、防止氧化損傷的效果，最終達(dá)到抗糖尿病、改善胰島素抵抗的作用。本研究表明，刺五加葉純化物比乙醇提取物和陽性藥物（參芪降糖膠囊）具有更加優(yōu)越的治療2型糖尿病的作用，并呈現(xiàn)劑量正相關(guān)，有望開發(fā)成為新一代的降血糖藥物。

本實(shí)驗(yàn)試圖將刺五加葉（葉類藥材）這一資源豐富的中藥資源進(jìn)一步開發(fā)成為治療糖尿病的新型現(xiàn)代中藥。這對于預(yù)防和治療糖尿病、促進(jìn)中醫(yī)藥治療糖尿病的現(xiàn)代化發(fā)展具有一定的研究意義，同時(shí)也可擴(kuò)大其藥用資源，促進(jìn)其種植資源保護(hù)，產(chǎn)生更大經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

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（收稿日期：2015-11-14） （本文編輯：王利）