百里醌抑制體外骨肉瘤細胞轉移的實驗研究

周齊

【摘要】 目的：探討百里醌抑制體外骨肉瘤細胞轉移的作用及其機制。方法：本研究應用不同濃度百里醌作用人骨肉瘤SaOS-2細胞后，觀察百里醌對體外骨肉瘤SaOS-2細胞遷移和侵襲的作用；Western blotting檢測骨肉瘤細胞中MMP-2和MMP-9表達的變化。結果：百里醌可呈濃度依賴性抑制體外人骨肉瘤骨肉瘤SaOS-2細胞遷移和侵襲，同時百里醌可下調骨肉瘤SaOS-2細胞中MMP-2和MMP-9的表達。結論：百里醌可抑制體外骨肉瘤細胞轉移，該作用可能通過下調MMP-2和MMP-9的表達而實現。

【關鍵詞】 骨肉瘤； 百里醌； 轉移

【Abstract】 Objective：To investigate the anti-metastasis effect and its mechanism of thymoquinone on the osteosarcoma SaOS-2 cell line in vitro.Method：In the study，after application of different concentrations of thymoquinone in the role of human osteosarcoma SaOS-2 cells，the effects of thymoquinone on the migration and invasion of osteosarcoma SaOS-2 cells were examined by using wound assay and matrigel counting.Western blotting was used to detect the protein expression of MMP-2 and MMP-9 in SaOS-2 cells.Result：Thymoquinone significantly suppressed the migration and invasion of osteosarcoma SaOS-2 cells in a concentration depended manner.The expression of MMP-2 and MMP-9 were down-regulated in osteosarcoma SaOS-2 cells after treatment of thymoquinone.Conclusion：Thymoquinone exerts anti-metastatic activity in SaOS-2 cells in vitro，which may be achieved by down-regulating the expression of MMP-2 and MMP-9.

【Key words】 Osteosarcoma； Thymoquinone； Metastasis

First-authors address：The First Peoples Hospital of Yueyang，Yueyang 414000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.007

百里醌（Oridonin）是從唇形科（Labtea）香茶菜屬（Rabdosia）植物中分離出的一種貝殼杉烯二萜類（ent-kaurene diterpenoid）天然有機化合物，目前研究結果表明，百里醌能夠抑制如前列腺癌、宮頸癌、肝癌和肺癌等多種腫瘤細胞增殖，并對細胞轉移有一定抑制作用[1-6]。但目前尚未有百里醌對骨肉瘤轉移的抑制作用的研究報道，為此本研究將觀察百里醌對體外人骨肉瘤細胞轉移的作用，并初步探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 胰酶、胎牛血清和RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；MMP-2、MMP-9和β-actin抗體購自美國Epitomics公司；Transwell小室購自美國Corning公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒和結晶紫染色試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司；人工重組基底膜（matrigel）和百里醌購自美國Sigma公司，百里醌用含30%DMSO的滅菌三蒸水配成5 mmol/L母液，置-20 ℃保存，應用時加RPMI-1640培養基稀釋成目標濃度（DMSO的終濃度<0.1%，該濃度對細胞無明顯毒副作用。

1.2 細胞株及細胞培養 人骨肉瘤細胞株SaOS-2購自ATCC，培養在含l0%胎牛血清、質量濃度1×105 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氫鈉的RPMI-1640培養液中，置于37 ℃、5%的CO2的培養箱內培養，2～3 d換液1次，細胞單層貼壁生長至70%～80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

1.3 細胞遷移實驗 將對數生長期的SaOS-2細胞制成單細胞懸液，不同濃度百里醌（10、20、

40 μmol/L）作用2 h后，在培養皿上用200 μL槍頭小心刮出2 mm×2 cm 刮痕，經PBS沖洗2次，在顯微鏡下見刮痕內無細胞殘留后放置培養箱繼續培養24 h，置于倒置顯微鏡下觀察細胞劃痕并計算各組細胞的劃痕修復率，實驗重復3次，取平均值。劃痕修復率（%）=[（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度]×100%。

1.4 細胞侵襲實驗 不同濃度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用骨肉瘤細胞2 h后，用無血清RPMI-1640培養基將細胞制成單細胞懸液，取1×104個細胞置于Transwell小室的上室，下層加500 μL含20%胎牛血清的培養基，放置細胞培養箱中培養24 h后取出濾膜，用棉簽小心擦去小室內膜上未穿過膜的細胞，細胞固定后用結晶紫染色，置于倒置顯微鏡下觀察染色后的細胞并計數，隨機計數20個視野，計算平均值。

1.5 Western印跡檢測細胞中MMP-2和MMP-9的表達 裂解細胞并分離細胞蛋白質，用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品（20 μg/孔），常規8% SDS-PAGE電泳，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入特異性一抗（1∶1000）于4 ℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為第二抗體（1∶2500）室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶曝光強度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）軟件分析，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比得出目的條帶的相對表達水平。

1.6 統計學處理 采用SPSS 11.0軟件包進行統計學處理，計量資料用（x±s）表示，正態分布變量多組間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 百里醌對體外骨肉瘤細胞遷移的作用 百里醌可呈濃度依賴性顯著抑制SaOS-2細胞遷移（圖1）。百里醌（10、20、40 μmol/L）作用SaOS-2細胞2 h后，細胞劃痕修復率分別為（65.42±7.82）%、（52.66±6.37）%和（40.95±5.37）%，與對照組的（86.05±8.34）%相比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.2 百里醌對體外骨肉瘤細胞侵襲的作用 百里醌可呈濃度依賴性抑制體外骨肉瘤SaOS-2細胞侵襲（圖2）。百里醌（10、20、40 μmol/L）處理SaOS-2細胞2 h后每高倍鏡（×200）下侵襲細胞數分別為（21.5±3.8）、（22.9±2.8）和（17.5±3.1），與對照組的（45.4±5.7）相比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。為驗證百里醌對SaOS-2細胞遷移和侵襲的作用并非由于百里醌的細胞增殖抑制作用所造成，預實驗表明，高濃度百里醌（40 μmol/L）作用SaOS-2細胞2 h后對SaOS-2細胞增殖無明顯抑制作用。

2.3 百里醌對SaOS-2細胞中MMP-2和MMP-9表達的影響 如圖3所示，不同濃度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用SaOS-2細胞48 h后，Western印跡表明，相對較低濃度（10 μmol/L）的百里醌對SaOS-2細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達無明顯影響，但高濃度（20～40 μmol/L）的百里醌作用SaOS-2細胞后，細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平開始下調，以40 μmol/L百里醌作用后對MMP-2和MMP-9蛋白表達下調效應最顯著。

3 討論

在本研究中，為檢驗百里醌對體外骨肉瘤細胞轉移的抑制作用，筆者采用劃痕試驗和Transwell小室試驗模擬骨肉瘤細胞體外轉移過程，結果表明在本次實驗濃度和實驗時間下的百里醌未表現出對骨肉瘤SaOS-2細胞明顯的增值抑制作用，與文獻[7]報道相符，同時在該濃度和作用時間內百里醌可明顯抑制SaOS-2細胞的體外遷移運動和侵襲行為，從而首次在體外實驗中驗證了百里醌抗骨肉瘤細胞轉移的效應，表明百里醌作為一種低毒高效的腫瘤轉移抑制劑應用于骨肉瘤治療的巨大前景。

腫瘤轉移是一個十分復雜的動態連續的過程，三步驟學說是當前腫瘤轉移的權威學說 [8-11]，三步驟包括如下，（1）分離：腫瘤細胞之間黏附能力下降，腫瘤細胞開始脫離原發灶；（2）降解：腫瘤細胞開始分泌水解酶，從而降解細胞外基質（ECM）成分以及基底膜中的蛋白成分；（3）移動：癌細胞通過水解基底膜后形成的組織間隙從而向周圍組織浸潤甚至進入淋巴管和/或血管，最終實現遠處轉移。在腫瘤轉移的過程中，細胞穿過細胞外基質從而實現腫瘤細胞侵襲是腫瘤轉移過程中最重要的環節，而基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是在細胞侵襲和遠處轉移等多種惡性生物學行為中發揮了關鍵作用，MMP-2和MMP-9作為MMPs家族中最重要的成員，在正常生理條件下，MMP-2和MMP-9蛋白能夠降解細胞外基質成分，調節細胞間黏附，同時MMP-2和MMP-9蛋白還可作用于細胞外成分或其他蛋白成分而啟動其潛在生物學功能，并直接或間接參與胚胎發育、組織模型再塑及創傷修復等正常生理功能。在病理情況下，MMP-2和MMP-9蛋白可破壞基底膜成分和降解細胞外基質中膠原成分，使得腫瘤細胞突破原發部位正常基底膜而發生侵襲和轉移[12-15]。MMP-2和MMP-9在腫瘤細胞中過度表達并分解細胞外基質，使腫瘤細胞向深層組織浸潤并突破血管和淋巴管而進入相應管腔中，造成惡性腫瘤的血行和淋巴轉移，同時MMP-2和MMP-9蛋白還可以調控血管內皮生長因子（VEGF），從而在促進血管生成中發揮了一定作用。因此，抑制MMP-2和MMP-9的表達能有效抑制惡性腫瘤轉移。在本研究中，百里醌可抑制MMP-2和MMP-9蛋白在體外SaOS-2細胞中表達，同時百里醌對體外SaOS-2細胞遷移和侵襲有顯著的抑制作用，從而提示百里醌可能部分通過抑制MMP-2和MMP-9的表達從而抑制SaOS-2細胞轉移。

總之，本次實驗結果表明百里醌可顯著抑制體外SaOS-2細胞轉移，同時百里醌還可以抑制MMP-2和MMP-9蛋白在SaOS-2細胞中的表達。因此，筆者推斷百里醌可能通過抑制MMP-2和MMP-9從而抑制體外SaOS-2細胞轉移，但還需大量工作研究百里醌抑制SaOS-2細胞轉移的更多機制。

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（收稿日期：2015-08-13） （本文編輯：歐麗）