百里醌抑制體外骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究

周齊

【摘要】 目的：探討百里醌抑制體外骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制。方法：本研究應(yīng)用不同濃度百里醌作用人骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞后，觀察百里醌對(duì)體外骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞遷移和侵襲的作用；Western blotting檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)的變化。結(jié)果：百里醌可呈濃度依賴性抑制體外人骨肉瘤骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞遷移和侵襲，同時(shí)百里醌可下調(diào)骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)。結(jié)論：百里醌可抑制體外骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，該作用可能通過(guò)下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】 骨肉瘤； 百里醌； 轉(zhuǎn)移

【Abstract】 Objective：To investigate the anti-metastasis effect and its mechanism of thymoquinone on the osteosarcoma SaOS-2 cell line in vitro.Method：In the study，after application of different concentrations of thymoquinone in the role of human osteosarcoma SaOS-2 cells，the effects of thymoquinone on the migration and invasion of osteosarcoma SaOS-2 cells were examined by using wound assay and matrigel counting.Western blotting was used to detect the protein expression of MMP-2 and MMP-9 in SaOS-2 cells.Result：Thymoquinone significantly suppressed the migration and invasion of osteosarcoma SaOS-2 cells in a concentration depended manner.The expression of MMP-2 and MMP-9 were down-regulated in osteosarcoma SaOS-2 cells after treatment of thymoquinone.Conclusion：Thymoquinone exerts anti-metastatic activity in SaOS-2 cells in vitro，which may be achieved by down-regulating the expression of MMP-2 and MMP-9.

【Key words】 Osteosarcoma； Thymoquinone； Metastasis

First-authors address：The First Peoples Hospital of Yueyang，Yueyang 414000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.007

百里醌（Oridonin）是從唇形科（Labtea）香茶菜屬（Rabdosia）植物中分離出的一種貝殼杉烯二萜類（ent-kaurene diterpenoid）天然有機(jī)化合物，目前研究結(jié)果表明，百里醌能夠抑制如前列腺癌、宮頸癌、肝癌和肺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖，并對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移有一定抑制作用[1-6]。但目前尚未有百里醌對(duì)骨肉瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用的研究報(bào)道，為此本研究將觀察百里醌對(duì)體外人骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 胰酶、胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MMP-2、MMP-9和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和結(jié)晶紫染色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司；人工重組基底膜（matrigel）和百里醌購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，百里醌用含30%DMSO的滅菌三蒸水配成5 mmol/L母液，置-20 ℃保存，應(yīng)用時(shí)加RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成目標(biāo)濃度（DMSO的終濃度<0.1%，該濃度對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞株SaOS-2購(gòu)自ATCC，培養(yǎng)在含l0%胎牛血清、質(zhì)量濃度1×105 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氫鈉的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)胰蛋白酶消化傳代。

1.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SaOS-2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，不同濃度百里醌（10、20、

40 μmol/L）作用2 h后，在培養(yǎng)皿上用200 μL槍頭小心刮出2 mm×2 cm 刮痕，經(jīng)PBS沖洗2次，在顯微鏡下見(jiàn)刮痕內(nèi)無(wú)細(xì)胞殘留后放置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕并計(jì)算各組細(xì)胞的劃痕修復(fù)率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。劃痕修復(fù)率（%）=[（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度]×100%。

1.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 不同濃度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用骨肉瘤細(xì)胞2 h后，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，取1×104個(gè)細(xì)胞置于Transwell小室的上室，下層加500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出濾膜，用棉簽小心擦去小室內(nèi)膜上未穿過(guò)膜的細(xì)胞，細(xì)胞固定后用結(jié)晶紫染色，置于倒置顯微鏡下觀察染色后的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)20個(gè)視野，計(jì)算平均值。

1.5 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá) 裂解細(xì)胞并分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，用Bradford法測(cè)量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（20 μg/孔），常規(guī)8% SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入特異性一抗（1∶1000）于4 ℃下孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體（1∶2500）室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶曝光強(qiáng)度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）軟件分析，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)與內(nèi)參的灰度比得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用（x±s）表示，正態(tài)分布變量多組間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 百里醌對(duì)體外骨肉瘤細(xì)胞遷移的作用 百里醌可呈濃度依賴性顯著抑制SaOS-2細(xì)胞遷移（圖1）。百里醌（10、20、40 μmol/L）作用SaOS-2細(xì)胞2 h后，細(xì)胞劃痕修復(fù)率分別為（65.42±7.82）%、（52.66±6.37）%和（40.95±5.37）%，與對(duì)照組的（86.05±8.34）%相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 百里醌對(duì)體外骨肉瘤細(xì)胞侵襲的作用 百里醌可呈濃度依賴性抑制體外骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞侵襲（圖2）。百里醌（10、20、40 μmol/L）處理SaOS-2細(xì)胞2 h后每高倍鏡（×200）下侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（21.5±3.8）、（22.9±2.8）和（17.5±3.1），與對(duì)照組的（45.4±5.7）相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。為驗(yàn)證百里醌對(duì)SaOS-2細(xì)胞遷移和侵襲的作用并非由于百里醌的細(xì)胞增殖抑制作用所造成，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，高濃度百里醌（40 μmol/L）作用SaOS-2細(xì)胞2 h后對(duì)SaOS-2細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用。

2.3 百里醌對(duì)SaOS-2細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響 如圖3所示，不同濃度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用SaOS-2細(xì)胞48 h后，Western印跡表明，相對(duì)較低濃度（10 μmol/L）的百里醌對(duì)SaOS-2細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響，但高濃度（20～40 μmol/L）的百里醌作用SaOS-2細(xì)胞后，細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平開(kāi)始下調(diào)，以40 μmol/L百里醌作用后對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)下調(diào)效應(yīng)最顯著。

3 討論

在本研究中，為檢驗(yàn)百里醌對(duì)體外骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，筆者采用劃痕試驗(yàn)和Transwell小室試驗(yàn)?zāi)M骨肉瘤細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移過(guò)程，結(jié)果表明在本次實(shí)驗(yàn)濃度和實(shí)驗(yàn)時(shí)間下的百里醌未表現(xiàn)出對(duì)骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞明顯的增值抑制作用，與文獻(xiàn)[7]報(bào)道相符，同時(shí)在該濃度和作用時(shí)間內(nèi)百里醌可明顯抑制SaOS-2細(xì)胞的體外遷移運(yùn)動(dòng)和侵襲行為，從而首次在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了百里醌抗骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，表明百里醌作為一種低毒高效的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑應(yīng)用于骨肉瘤治療的巨大前景。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)十分復(fù)雜的動(dòng)態(tài)連續(xù)的過(guò)程，三步驟學(xué)說(shuō)是當(dāng)前腫瘤轉(zhuǎn)移的權(quán)威學(xué)說(shuō) [8-11]，三步驟包括如下，（1）分離：腫瘤細(xì)胞之間黏附能力下降，腫瘤細(xì)胞開(kāi)始脫離原發(fā)灶；（2）降解：腫瘤細(xì)胞開(kāi)始分泌水解酶，從而降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分以及基底膜中的蛋白成分；（3）移動(dòng)：癌細(xì)胞通過(guò)水解基底膜后形成的組織間隙從而向周圍組織浸潤(rùn)甚至進(jìn)入淋巴管和/或血管，最終實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，細(xì)胞穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中最重要的環(huán)節(jié)，而基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是在細(xì)胞侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等多種惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，MMP-2和MMP-9作為MMPs家族中最重要的成員，在正常生理?xiàng)l件下，MMP-2和MMP-9蛋白能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附，同時(shí)MMP-2和MMP-9蛋白還可作用于細(xì)胞外成分或其他蛋白成分而啟動(dòng)其潛在生物學(xué)功能，并直接或間接參與胚胎發(fā)育、組織模型再塑及創(chuàng)傷修復(fù)等正常生理功能。在病理情況下，MMP-2和MMP-9蛋白可破壞基底膜成分和降解細(xì)胞外基質(zhì)中膠原成分，使得腫瘤細(xì)胞突破原發(fā)部位正常基底膜而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[12-15]。MMP-2和MMP-9在腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)并分解細(xì)胞外基質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞向深層組織浸潤(rùn)并突破血管和淋巴管而進(jìn)入相應(yīng)管腔中，造成惡性腫瘤的血行和淋巴轉(zhuǎn)移，同時(shí)MMP-2和MMP-9蛋白還可以調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），從而在促進(jìn)血管生成中發(fā)揮了一定作用。因此，抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)能有效抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移。在本研究中，百里醌可抑制MMP-2和MMP-9蛋白在體外SaOS-2細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)百里醌對(duì)體外SaOS-2細(xì)胞遷移和侵襲有顯著的抑制作用，從而提示百里醌可能部分通過(guò)抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)從而抑制SaOS-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

總之，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明百里醌可顯著抑制體外SaOS-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移，同時(shí)百里醌還可以抑制MMP-2和MMP-9蛋白在SaOS-2細(xì)胞中的表達(dá)。因此，筆者推斷百里醌可能通過(guò)抑制MMP-2和MMP-9從而抑制體外SaOS-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但還需大量工作研究百里醌抑制SaOS-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移的更多機(jī)制。

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（收稿日期：2015-08-13） （本文編輯：歐麗）