結腸癌與直腸癌在癌變分子機制及信號通路方面的對比

鄧艷　柯晴

【摘要】 目的：探討結腸癌和直腸癌在癌變相關分子機制方面的異同。方法：選取本院2013年

1月-2014年12月30例結腸癌和30例直腸癌組織標本用于基因突變檢測，分別設為結腸癌組與直腸癌組，各8例新鮮的結腸癌和直腸癌組織標本用于信號通路檢測，比較不同標本的蛋白表達陽性率和信號通路。結果：兩組APC、Wnt-1和p53基因蛋白表達情況比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。直腸癌組PSM2和MLH1蛋白表達陽性率均顯著高于結腸癌組，比較差異均有統計學意義（P<0.01）；結腸癌組MSH2和MSH6蛋白表達陽性率均顯著高于直腸癌組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。結腸癌組K-ras突變率顯著高于直腸癌組，比較差異有統計學意義（P=0.038）；結腸癌和直腸癌共有的信號通路為代謝通路、Wnt/β-catenin、血管平滑肌收縮通路、緊密連接通路和細胞周期通路，且這些通路相關的差異基因表達大部分；而軸突導向通路僅出現在直腸癌中，p53基因信號通路、藥物代謝-細胞色素P450通路大量出現于結腸癌中。結論：結腸癌和直腸癌在癌變相關分子機制方面既有共性，也有個性：共性表現為Wnt信號通路、變異型p53蛋白和APC蛋白在二者癌變過程中發揮重要作用；個性表現為結腸癌中存在大量錯配修復基因突變蛋白表達缺失，以PSM2和MLH1為主，而直腸癌以MSH2與MSH6為主。

【關鍵詞】 結腸癌； 直腸癌； 分子機制

【Abstract】 Objective：To explore the similarities and differences between colon cancer and rectal cancer in oncogenesis molecular mechanism.Method：Each 30 cases of colon cancer and rectal cancer tissue specimens in our hospital from January 2013 to December 2014 were used for gene mutation detection，each eight fresh tissue specimens of colon cancer and rectal cancer were used for signaling pathways detection.The positive rate of protein expression and the signaling pathways of different specimens were compared.Result：The differences in protein expression of APC，Wnt-1 and p53 gene between the two groups were not statistically significant（P>0.05）.The positive rates of PSM2 and MLH1 protein expression in the rectal cancer group were higher than those in the colon cancer group，the differences were statistically significant（P<0.01）.The positive rates of MSH2 and MSH6 protein expression in the colon cancer group were higher than those in the rectal cancer group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The mutation rate of K-ras in the colon cancer group was higher than that in the rectal cancer group，the difference was statistically significant（P=0.038）.The common signal pathways of colon cancer and rectal cancer were metabolic pathway，Wnt/β-catenin，pathway of vascular smooth muscle contraction，closely connected pathway and cell cycle pathway.Most differential genes related to these pathways expressed.Axon guidance pathway appeared only in rectal cancer.Signaling pathway of p53 gene and drug metabolizing-cytochrome P450 pathway most appeared in colon cancer.Conclusion：Colon and rectal cancer have common and personal molecular mechanism.Their common manifestations show that Wnt signaling pathway，mutant p53 protein and APC protein play an important role in carcinogenesis process.Their individualitys show that presence of large mismatch repair gene mutations that cause protein loss mainly consists of PSM2 and MLH1 in colon cancer，but it mainly consists of MSH2 and MSH6 in rectal cancer.

【Key words】 Colon cancer； Rectal cancer； Molecular mechanism

First-authors address：The Second Peoples Hospital of Nanning City，Nanning 530031，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.021

結腸癌和直腸癌均為消化系統常見的腫瘤類型，其發病率隨著人類生活的改善而逐漸升高，其死亡率位于惡性腫瘤的第4位[1]。我國流行病學調查表明二者的發病率和病因學方面存在顯著差異，即結腸癌與人類生活習慣、飲食結構相關，直腸癌與地域、人種相關，故其在發生和發展中必然存在差異[2]。腫瘤的癌變機制通常為多基因改變、表達調控失調或傳導路徑變化造成，不同疾病癌變機制正處于研究中[3]。其中結腸癌和直腸癌癌變機制研究較為透徹，認為由其生長調控基因p53、K-ras和APC突變導致蛋白表達異常，進而引起正常上皮-管狀腺瘤-絨毛狀腺瘤-重度增生-腫瘤形成的癌變過程。盡管癌變機制研究較為清楚，但這類研究大部分針對結腸癌或捆綁二者一起研究，未區分二者，導致人們無法了解二者癌變過程和癌變機制的差別。本文對本院收治的患者進行基因突變檢測和基因芯片檢測，旨在探討結腸癌和直腸癌在癌變分子機制方面的異同，為不同類型腫瘤的早期診斷和預防以及開展腫瘤篩查提供相應的理論參考，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2013年1月-2014年

12月收治的30例結腸癌患者和30例直腸癌患者手術后的石蠟組織標本為基因突變檢測對象，其中直腸癌組男15例，女15例，年齡50～70歲，平均（60.1±4.8）歲；結腸癌組男17例，女13例，年齡51～73歲，平均（61.1±5.1）歲。所有患者術后分期均為Duke B期，無淋巴結轉移和遠處轉移。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性?；蛐酒瑱z測對象為直腸癌和結腸癌手術后新鮮冷凍的各8例組織樣本，兩組各含男4例，女4例，年齡50～70歲，平均（65.3±4.1）歲；結腸癌患者病變部位為升結腸，病理類型為中高分化腺癌，腫瘤分期為Duke B型，直腸癌患者病變部位為直腸，病理類型為中高分化腺癌，腫瘤分期為Duke B型，兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 HE切片觀測 在光鏡下對各個標本的HE切片進行觀測，其中包含1個正常的黏膜組織以及另外2個腫瘤組織。使用組織陣列儀做出9個組織芯片的蠟塊，并將其放置在溫度為4 ℃的冰箱中儲存。把做好的組織芯片放置在切片機上制作出5 μm的連續切片，選出組織芯片較為完整的移到56 ℃的水中展開，并且用玻片將其撈出。之后采用免疫組織化學法進行染色處理，過程使用S-P法，按照試劑說明書進行。對各個指標的陽性以及陰性表達進行檢測：CyclinD1以及Survivin在患者體內細胞核中定位，c-myc以及β-catenin、TCF4、PPARγ在細胞漿以及細胞核中進行定位，Wnt-1、MMP-7以及CD44v7在細胞漿中進行定位。依據陽性細胞數目以及著色的深度進行積分，每例進行5個高倍鏡視野范圍（×400）的隨機觀測。

1.2.2 基因突變檢測 采用免疫組化方法檢測APC、p53、Wnt-1、PSM2、MLH1、MSH2和MSH6蛋白水平[4]。具體操作方法：準備組織切片-脫蠟入水-PBS浸洗-熱修復-PBS浸洗-滅活-加入牛血清-加入蛋白孵育-PBS浸洗-加入二抗工作液-PBS浸洗-DAB染色觀察陽性結果-蘇木復染，鹽酸乙醇分化，熱水反藍，梯度乙醇脫水得中性數膠封片，觀察。顯微鏡觀察方法：隨機選取10個視野，每視野含100個細胞觀察。免疫組化陽性信號為棕黃色顆粒，觀察染色強度和部位，并計數。具體染色結果判斷參照文獻進行。采用RT-PCR擴增，以獲取其基因突變情況。

1.2.3 基因芯片檢測 采用Human WG06v3.0 Expression BeadChip表達芯片進行。試驗流程：提取RNA-合成cDNA-純化并反轉錄-純化并檢測質量-與雜交試劑混合-孵育-洗滌-Block-觀察信號-洗滌-干燥-獲取圖像數據。其中RNA的提取采用Trizol一步法進行[5]。RNA的擴增采用PCR進行[6]。所得數據采用marray軟件可視化芯片數據，對其歸一化后進行信號篩選[7]。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計分析軟件對研究數據進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組癌變基因蛋白表達情況比較 兩組APC、Wnt-1和p53基因蛋白表達情況比較，差異無統計學意義（P>0.05）。錯配修復基因表達蛋白檢測后發現：直腸癌組PSM2和MLH1蛋白表達陽性率顯著高于結腸癌組，比較差異有統計學意義（P<0.01）；結腸癌組MSH2和MSH6蛋白表達陽性率顯著高于直腸癌組，比較差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 兩組癌變基因比較 結腸癌組K-ras突變率高達60.0%（18/30），顯著高于直腸癌組的33.3%（10/30），比較差異有統計學意義（ 字2=4.286，P=0.038）。

2.3 結腸癌與直腸癌癌變信號通路比較 結腸癌和直腸癌共有的信號通路為代謝通路、Wnt/β-catenin、血管平滑肌收縮通路、緊密連接通路和細胞周期通路，且這些通路相關的差異基因表達大部分；而軸突導向通路僅出現在直腸癌中，p53基因信號通路、藥物代謝-細胞色素P450通路大量出現于結腸癌中。

3 討論

隨著人類生活水平提高和生活質量的改善，消化性腫瘤如結腸癌、直腸癌等惡性腫瘤發病率逐年升高。結腸癌和直腸癌已經發展成為常見的惡性腫瘤，目前全球每年新增病例近60萬例。因此，如何早期發現、早期診斷及采取有效治療方案降低結、直腸癌的發病率和死亡率，已成為目前研究的熱點之一。腫瘤分子生物學的變化在許多的臨床腫瘤中被證實是一種判斷轉移以及對預后進行預測的指標。研究結、直腸癌的早期的診斷方式，探索結、直腸癌轉移、復發及預后相關的針對性指標對結、直腸癌的輔助診斷與遠期治療具有十分重要的意義。近年來大量關于結腸癌和直腸癌研究的文章得以發表，但尚無研究人員對兩者的癌變機制差異進行研究。文獻[8]表明兩者在檢查和診斷之間存在差異，文獻[9]報道兩者的基因突變和蛋白表達方面存在差異。因此，本文采用基因突變檢測和芯片檢測，對癌變的分子機制進行探討。

自1998年Vogelstein等提出結直腸癌癌變分子生物學機制以來，人們逐漸認同了結腸癌癌變是由于p53/k-ras和APC等主要基因突變（染色體不穩定）引起蛋白表達異常，導致腺瘤轉化為腫瘤，說明Wnt信號途徑的異常激活是引起癌變的主要原因[10]。進一步研究發現，染色體不穩定是由于錯配修復基因突變造成修復功能喪失造成，即DNA復制過程中錯配序列得不到正常修復，引起調節生長繁殖的靶基因突變導致癌變產生（微衛星不穩定途徑）[11]。近年來發現這一途徑與腫瘤部位和基因改變有關，提示結腸癌和直腸癌的癌變途徑可能存在差異[12]。經免疫組化檢測表明，兩組APC、Wnt-1和p53基因蛋白表達情況比較，差異無統計學意義（P>0.05），說明結直腸癌的APC、Wnt-1和p53三種基因缺失不存在差異，但信號通路激活方式是否存在差異有待于進一步研究[13]。錯配修復基因表達蛋白檢測后發現：直腸癌組PSM2和MLH1蛋白表達陽性率顯著高于結腸癌組，比較差異有統計學意義（P<0.01）；結腸癌組MSH2和MSH6蛋白陽性率顯著高于直腸癌組，比較差異有統計學意義（P<0.05），說明存在大量錯配修復基因突變導致蛋白表達缺失，結腸癌以PSM2和MLH1為主，而直腸癌以MSH2和MSH6為主。另外，結腸癌組K-ras突變率顯著高于直腸癌組，比較差異有統計學意義（ 字2=4.286，P=0.038），進一步驗證了上述結果。

在上述研究的基礎上接著 基因芯片對癌變的信號通路進行了研究，進而篩選出差異基因相關的信號通路。研究發現，結腸癌和直腸癌共有的信號通路為代謝通路、Wnt/β-catenin、血管平滑肌收縮通路、緊密連接通路和細胞周期通路，且這些通路相關的差異基因表達大部分；而軸突導向通路僅出現在直腸癌中，p53基因信號通路、藥物代謝-細胞色素P450通路大量出現于結腸癌中，說明兩者癌變具有共同的和各自的信號通路。另外上述部分差異基因的相關通路已經得以證實，另一部分尚未證實的通路有待于進一步研究明確其機制[14]。

綜上所述，結腸癌和直腸癌在癌變相關分子機制方面既有共性，也有個性[15]。共性表現為Wnt信號通路、變異型p53蛋白和APC蛋白在兩者癌變過程中發揮重要作用；個性變現為結腸癌中以PSM2和MLH1為主存在大量錯配修復基因突變，而直腸癌以MSH2和MSH6為主。另外，軸突導向通路僅出現在直腸癌中，p53基因信號通路、藥物代謝-細胞色素P450通路大量出現于結腸癌中。

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（收稿日期：2015-05-25） （本文編輯：王利）