不同種類魚中snrpc的組織表達特征研究

王紅瑩+方瑞

摘 要：為了深入研究魚類RNA剪接相關基因snrpc的作用機制，實驗應用RT-PCR研究了斑馬魚成魚組織中snrpc mRNA的表達模式，并比較分析了鯽魚中snrpc的表達。結果顯示，斑馬魚snrpc在垂體和卵巢中有表達，而鯽魚中在腎臟、垂體和卵巢中有表達，表明snrpc在不同魚類中具有組織表達的差異性。

關鍵詞：斑馬魚；snrpc；組織表達分析

中圖分類號 S965.299 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）08-21-02

Abstract：In order to further study the mechanism of fish's snrpc relevant to RNA splicing，we researched the expression of mRNA in zebrafish's and crucian carp's tissues by RT-PCR. Zebrafish's snrpc expression in the pituitary and oocyte，while the crucian carp's expression in kidney pituitary and oocyte. Preliminary results show that zebrafish's snrpc has specific expression in different tissue.

Key words：Zebrafish；Snrpc；Tissue distribution

在負責RNA剪切的因子中，snRNP蛋白是最關鍵的一類。SNRPC是snRNP蛋白中的一種，但至今研究仍較少。在魚類早期發育過程中，細胞的快速分裂需要RNA的正確剪切，推測SNRPC在此過程中發揮著重要的功能。本研究中應用RT-PCR研究斑馬魚以及經濟魚類鯽魚成魚組織中snrpc mRNA的表達模式，以期進一步揭示SNRPC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 （1）實驗品種：斑馬魚、鯽魚。（2）主要儀器及設備：Sequi-Gen電泳儀系統，Bio-RabGONGSI；定量移液器，Gilson；凝膠成像系統，Bio-RabGONGSI；PCR儀，Bio-RabGONGSI；恒溫搖床、隔水式恒溫培養箱、低溫水浴鍋、高速冷凍離心機、超凈工作臺、恒溫水浴鍋，上海精宏。（3）主要試劑：PCR taq酶，TaKaRa；限制性內切酶，NEB；質粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒、酶切膠回收試劑盒，上海生工；Trizol、逆轉錄試劑盒，TOYOBO。

1.2 實驗方法

1.2.1 snrpc基因引物的設計 根據NCBI上預測的snrpc的全長序列，利用primer 5.0設計引物。

1.2.2 mRNA及蛋白表達水平的檢測

1.2.2.1 斑馬魚及鯽魚中各組織總RNA的提取及cDNA合成 斑馬魚和鯽魚各10條，分別取心臟、肝臟、腎臟、脾臟、脂肪、肌肉、垂體、下丘腦、端腦、小腦、延髓、精巢、卵巢50～100mg，各加600μL TRIZOL；研磨并靜置3min，加氯仿抽提，離心后將上清液轉到新Rnase-free EP管中，在管中加入等體積的異丙醇沉淀；用75%乙醇洗滌，最后溶于Rnase free的ddH2O中。提取的RNA加入oligo dT引物，70℃孵育后加入RNA酶抑制劑1μL，dNTP 5μL，逆轉錄酶1μL，42℃逆轉錄，得到各組織cDNA。

1.2.2.2 RT-PCR檢測mRNA水平 RT-PCR中使用到的引物如下：

PCR擴增后用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

2 結果與分析

2.1 snrpc在斑馬魚成魚各組織中mRNA的表達 通過提取各組織的總RNA，逆轉錄合成cDNA，再以α-tubulin作為內參，進行PCR反應，確保逆轉錄效率一致，再利用snrpc引物進行PCR擴增，通過電泳鑒定斑馬魚成魚各組織中mRNA水平，結果見圖1。由圖1可知，瓊（下轉130頁）（上接21頁）脂糖凝膠電泳檢測的結果，斑馬魚snrpc在垂體和卵巢中均有表達，且條帶大小正確清晰，表達量相當。

2.2 snrpc在鯽魚成魚各組織中mRNA的表達 由于斑馬魚各組織的特異性，筆者設計出一組對照實驗，即在鯽魚成魚各組織中檢測snrpc mRNA的表達，其結果見圖2。從圖2可以看出，鯽魚中snrpc mRNA在腎臟、垂體和卵巢中有表達。此結果與斑馬魚中不同。不同魚的snrpc在不同組織中表達，具有不同的生物學功能。

3 結論與討論

根據瓊脂糖凝膠電泳的檢測結果，斑馬魚中在P（垂體）和T（精巢）中有明顯的條帶，且條帶大小正確清晰，說明斑馬魚snrpc mRNA在垂體和精巢中具有組織特異性。而在鯽魚中，在K（腎臟）和P（垂體）、T（即精巢）中有明顯的條帶，說明鯽魚snrpc mRNA在腎臟、腦和精巢中具有組織特異性。魚類snrpc基因屬于差異表達基因，不同物種中具有不同的表達模式。據研究，snrpc基因在不同組織中表達的差異性與其RNA剪接活性有一定關系。此外，一些因子也和SNRPC共同作用并且參與了RNA的剪切。比如，轉錄因子EWS和其他轉錄因子結合后，再和SNRPC作用來進行RNA剪切的調節。TIA-1因子和U1 C蛋白共同作用后，可促進snRNP的剪接效率。SNRPC的N末端可以和谷氨酸富含區域的C末端產生互作。當然，要想了解snrpc基因在體內的功能還需通過基因敲除等技術，進一步研究其蛋白質的生物學功能，以揭示其在機體內的作用。

參考文獻

[1]Knoop L.L.，Baker S.J.The splicing factor U1C represses EWS/FLI-mediated transactivation[J].Biol.Chem.，2000，275：24865-24871.

[2]Ohkura N.，Yaguchi H.，Tsukada T.，et al.The EWS/NOR1 fusion gene product gains a novel activity affecting premRNA splicing[J].Biol.Chem.，2002，277：535-543.

[3]Tian Q.，Streuli M.，Saito H.，Schlossman S.F.，et al.A polyadenylate binding protein localized to the granules of cytolytic lymphocytes induces DNA fragmentation in target cells[J].Cell，1991，67：629-639.

[4]Fock W.L.，Chen C.L.，Lam T.J.，et al.Roles of an endogenous serum lectin in the immune protection of blue gourami，Trichogaster trichopterus（Pallus）against Aeromonas hydrophila[J].Fish.Shel.Immuno.，2001，11：101-113.

[5]Wang H.Y.，Zhou L.，Gui J.F.Identification and characterization of an oocyte-specific small nuclear ribonucleoprotein polypeptide C in gibel carp，Comp[J].Biochem .Phys .B，2007，146：47-52.

[6]王紅瑩，杜嫚.鯽魚一種新型SNRPC基因的蛋白表達和抗體制備分析[J].河北農業科學，2010，14（12）：43-45.

（責編：張宏民）