反復分批式反應提高磷脂酰絲氨酸的生產能力

封娟娟，朱南南，鄧楊敏，韓曉玲，張小里，趙彬俠（西北大學化工學院，陜西 西安 70069；西安力邦制藥有限公司，陜西 西安 70075）

?

反復分批式反應提高磷脂酰絲氨酸的生產能力

封娟娟1，朱南南1，鄧楊敏1，韓曉玲2，張小里1，趙彬俠1
（1西北大學化工學院，陜西 西安 710069；2西安力邦制藥有限公司，陜西 西安 710075）

摘要：磷脂酶D（PLD）催化大豆磷脂合成磷脂酰絲氨酸（PS）反應是在油-水兩相體系中進行的，大豆磷脂（PC）溶于有機相中，L-絲氨酸溶于水相中，但反應過程中產生副產物——膽堿，抑制酶的催化反應速率，需及時移除膽堿。本文主要采用反復分批式反應來解決這一問題。并考察了增大底物PC的濃度，PS的收率大大降低。低底物PC濃度下，添加不同濃度膽堿，轉酯速率及PS收率都降低；高底物PC濃度下，采用反復分批式反應去除膽堿，轉酯反應速率提高38％，PS收率達67％。研究表明反復分批式操作是一種生產磷脂的新型工藝，其中PS的生產能力明顯提高，而且重復10次反應后，固定化酶活力仍保持58％，納米SiO2固定化磷脂酶D較好地適用于反復分批式反應。

關鍵詞：磷脂酰絲氨酸；固定化磷脂酶D ；反復分批式反應 ；膽堿

第一作者：封娟娟（1989—），女，碩士研究生。E-mail juan026juan@163. com。聯系人：張小里，教授，博士生導師，研究方向為生物催化過程、催化反應工程。E-mail xlzhang@nwu.edu.cn。

磷脂酰絲氨酸（phosphatidyiserine，簡稱PS)是一種稀有磷脂，雖然在人體內數量極其稀少但功能顯著，具有提高大腦機能、集中注意力、改善記憶力、緩解壓力、促進用腦疲勞的恢復、平衡情緒、修復大腦損傷等功效[1]。它可影響腦信息的傳遞，并幫助大腦記憶的儲存和讀取，被譽為繼膽堿和“腦黃金”DHA之后的一大新興的“智能營養素”。

磷脂酰絲氨酸的主要制備途徑有提取法[2]和酶轉化法，研究發現，PS與磷脂酰膽堿（PC）以及磷脂酰乙醇胺（PE）等甘油磷脂產品可互相轉化，使得提取工藝復雜、費力。而且由于瘋牛病的原因，提取的PS產品安全性受到質疑，因此提取法已處于淘汰邊緣。

與提取法相比，酶轉化法[3]工藝簡單、條件溫和、產物收率高、低碳環保、產品安全，利用磷脂酶D的轉磷脂酰基特性，催化PC合成PS，廣泛引起了人們的關注。然而在磷脂酶D催化大豆磷脂（PC）合成PS的過程中，體系釋放出另一種產物膽堿，其與磷脂酶D相互作用，降低酶的活性，致使反應速率減慢，產品收率低。為了最大程度地提高反應收率，需將從反應混合物中移除膽堿。JUNEJA等[4]曾在該反應中加入膽堿氧化酶和過氧化氫酶去除膽堿，但這兩種酶比較昂貴，難以在大規模的工業中使用。本文采用反復分批式反應[5]實現了反應混合物中膽堿的移除，進而大大提高了反應收率。

1　材料與方法

1.1儀器與設備

臺式恒溫生化搖床，ZHWY-211C，上海智成分析儀器制造有限公司；分析天平，T-114，北京賽多利斯儀器系統用限公司；掃描儀，Pro800，佳能電器有限公司；薄層展開缸，PQ，上海信儀儀器有限公司；GF254薄層板，由實驗室自制；玻璃毛細點樣管，0.5mm×100mm，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2試劑與材料

磷脂酶D，由本實驗室保存的鏈霉菌株發酵制備；大豆磷脂，90％，北京美亞斯磷脂技術有限公司；氯化膽堿，國藥集團化學試劑有限公司；SiO2，30nm，阿拉丁試劑；L-絲氨酸，無錫市必勝化工產品有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3實驗方法

1.3.1磷脂酶D的固定化

由一株鏈霉菌發酵制備得的游離磷脂酶D一般為粗酶液。可采用乙醇分級沉淀法進行純化[6]：0℃，攪拌條件下，向粗酶液中快速滴加等量冷凍無水乙醇，冷凍離心去沉淀并收集上清液。以相同方式于0℃向清液中補加3倍量的冷凍乙醇，冷凍離心去清液并收集沉淀，反復多次后，獲得比活力為8.88 U/mg的純化磷脂酶D，達粗酶液比活力的12倍。

分離純化后的游離磷脂酶D與納米SiO2充分混合，置于搖床內吸附反應若干小時。校調體系pH值至一定值，在0℃、攪拌條件下快速滴加冷凍乙醇進行沉淀聚集，聚集后的沉淀與25％戊二醛交聯劑進行反應，洗滌后獲得固定化磷脂酶D。

1.3.2磷脂酶D催化合成磷脂酰絲氨酸

固定化磷脂酶D催化大豆磷脂合成磷脂酰絲氨酸的反應是在兩相體系中進行的，即大豆磷脂溶于有機溶劑乙醚，L-絲氨酸（PC濃度的100倍，大大過量）溶于0.2mol/L pH值為5.5的乙酸緩沖液。二者混合后加入固定化磷脂酶D，28℃、搖床轉速200r/min下在兩相界面上發生反應，對有機相進行間歇取樣，并用薄層色譜（TLC）進行分析。

磷脂酶D的轉酯活力被定義為：28℃下，單位時間內合成1μmol PS所需的固定化酶量，即為一個酶活力單位（1U）。

1.3.3抑制劑氯化膽堿的添加

在上述轉酯反應條件下，設置幾組平行實驗進行研究，分別添加不同濃度的氯化膽堿于水相體系中進行反應，間歇取樣分析，觀測膽堿的抑制作用。

1.3.4反復分批式反應

在上述轉酯反應條件下，每隔1h將水相從反應混合物中分離出來，緩沖液中的固定化磷脂酶D經濾紙過濾，并用乙酸緩沖液反復沖洗3次，回收進行二次利用。在反應體系中，添加新鮮的L-絲氨酸乙酸緩沖液為新的水相，進行第二批次的反應。反復進行多次，間歇取樣，進行磷脂的測定。

1.4磷脂分析方法

磷脂樣品用TLC檢測分析，GF254硅膠制成薄層板，取樣，點樣，走板，采用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸=13∶5∶0.8∶0.8（體積比）的展開劑展開，碘蒸氣染色。染色后用薄層掃描儀掃描，利用Photoshop和Gel-Pro分析儀計算斑點灰度值，計算出各種磷脂濃度。

2　結果與討論

2.1不同底物PC濃度對PS合成的影響

考察不同底物PC濃度對PS合成的影響，由圖1可知，反應90min后，當底物PC濃度為2mmol/L、6mmol/L、10mmol/L時，PS收率分別為57.34％、43.6％、38％。反應3.5h后，3種PC濃度所對應最大PS收率分別達57.34％、48.8％、48.2％。由圖1可知，隨著底物PC濃度的增大，PS的收率由57.34％降低到38％ 。

圖1　不同底物PC濃度對PS合成的影響

2.2不同膽堿濃度對PS合成的影響

在轉酯反應的水相中分別添加0、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L的氯化膽堿，其中PC濃度為2mmol/L，考察膽堿濃度對PS合成的影響。由圖2可知，初始轉酯速率隨著膽堿濃度的增加而呈現減小的趨勢。由于單位質量的酶催化磷脂量是一定的，而膽堿的加入會占用酶的立體空間，使底物與酶結合的概率變小，酶與中間產物不能及時結合進行下一步反應，致使催化反應速率會降低。膽堿含量較小時，抑制作用不明顯，膽堿含量越多，其抑制作用突出，膽堿濃度為6mmol/L時，速率由100％降至49.4％。

圖2　膽堿濃度對轉酯反應速率的影響

2.3反復分批式反應合成PS

反復分批式反應指不斷更換水相，即在高PC濃度（10mmol/L）下，移除水相中的膽堿，從而提高催化反應速率。由圖3所示，發現運用不同的操作方法，磷脂酶D催化的轉酯速率隨著反應時間的推移呈現持續減小的趨勢，分別在1h和2h換料并添加新的水相的情況下，換料后的催化反應速率明顯高于不換料的情況下，即1h時，反應速率增大8.9％，2h時速率增大38％，兩次換料后PS收率達67％。

圖3　反復分批式操作對轉酯反應速率的影響

2.4固定化PLD在合成PS中的操作穩定性

由圖4可知，固定化磷脂酶D在反復10批次反應后，仍保持較高的催化活性，其活力為58％。說明納米SiO2的球狀顆粒能緊鎖住固定在其上的酶分子，使酶的催化性能穩定，更好地適用于反復分批式反應。

圖4　固定化PLD重復使用次數與酶活力的關系

3　結論

增大底物（PC）的濃度，轉酯反應速率及PS的收率都降低，這可能是發生了可逆反應，或者反應過程中生成副產物膽堿，抑制酶的催化活性。本文在低底物PC濃度（2mmol/L）下，添加不同濃度的氯化膽堿，發現轉酯反應速率及PS收率大大降低；在高底物PC（10mmol/L）下，采用反復分批式反應，不斷更換水相，即移除水相中的膽堿，發現第二次換料后，轉酯速率增大38％。這證明在轉酯反應中副產物膽堿的存在，大大抑制反應的進行，采用反復分批式反應，去除膽堿，能有效提高PS的生產能力。反復10批次生產PS后，納米SiO2固定化PLD仍保留58％的相對活力，催化性能穩定。反復分批式反應工藝簡單，條件溫和，也可以應用于其他稀有磷脂的生產。

參考文獻

[1]王兆明，賀稚非，余力，等.動物源卵磷脂功效作用及其分析方法[J].食品工業科技，2014，35（9）：362-365.

[2]劉代成，楊雅婷.一種從動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法：200410024225[P].2005-02-23.

[3]胡飛，段章群，王淮，等.生物酶法制備磷脂酰絲氨酸的研究進展[J].油脂化工，2012，37（6）：54-58.

[4]JUNEJA L R，TANIGUCHI E，SHIMIZU S，et al.Increasing Productivity by removing choline in conversion of phosphatidylcholine to phosphatidylserine by phospholipase D[J].Journal of Fermentation and Bioengineering，1992，73：357-361.

[5]JUNEJA L R，HIB N，YAMANE T，et al.Repeated batch and continuous operations for phosphatidylglycerol synthesis from phosphatidylcholine with immobilized phospholipase D[J].Appl. Microbiol. Biotechnol.，1987，27：146-151.

[6]姚娜，張小里，趙彬俠，等.磷脂酶D催化大豆磷脂合成磷脂酰絲氨酸工藝[J].化工進展，2011，30（s1）：281-285.

Increasing productivity of phosphatidyserine by repeated batch reaction

FENG Juanjuan1，ZHU Nannan1，DENG Yangmin1，HAN Xiaoling2，ZHANG Xiaoli1，ZHAO Binxia1
（1College of Chemical Engineering，Northwest University，Xi’an 710069，Shaanxi，China;2Xi’an LIBANG Pharmaceutical Company Limited，Xi’an 710075，Shaanxi，China）

Abstract：The synthetic reaction of phosphatidyserine from soybean lecithin catalyzed by immobilized phospholipase D was carried out in oil-water two phase system，with PC and L-serine rich in oil and water phase，respectively. However，the by-product choline restrains the enzyme-catalyzed reaction rate and should be removed in time. In order to solve this problem，we adopted the repeated batch reaction. Increasing the substrate (PC) concentration decreased the yield of PS greatly. When various concentrations of choline chloride were added into the reaction mixture at low PC concentrations，there was a significant decrease in transphosphatidylation rate and the yield of PS. The using of repeated batch reaction was examined at high PC concentration to remove choline，the transphosphatidylation rate increased by 38％，and PS yield was 67％. The paper reported that the repeated batch operation is a novel technology for the synthesis of phosphlipid and increased the productivity of PS significantly. And the immobilized enzyme activity remained 58％ after ten batches and nano-SiO2-immobilized-PLD was suitable for repeated batch reaction.

Key words：phosphatidyserine; immobilized phospholipase D; repeated batch reaction; choline

中圖分類號：TQ 463

文獻標志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）04–1180–04

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.04.034

收稿日期：2015-08-24；修改稿日期：2015-10-21。

基金項目：陜西省自然科學基礎研究計劃項目（2014JM2057）。