檳榔籽乙醇提取物抗氧化性的研究

張璐，鄭亞軍，李艷，張有林，張潤光，張玉峰（.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安7006；.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌57339；3.海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海南海口5708）

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檳榔籽乙醇提取物抗氧化性的研究

張璐2，3，鄭亞軍1，2，李艷2，張有林1，*，張潤光1，張玉峰2
（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌571339；3.海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海南海口570228）

摘要：將檳榔籽干燥、粉碎后用75 %乙醇提取，以該提取液為研究對象，分析其對DPPH、羥基自由基、超氧根離子自由基、ABTS自由基的清除能力，并測試其還原力、對二價鐵離子的絡(luò)合能力和對亞油酸自氧化的抑制能力，綜合分析其體外抗氧化能力。結(jié)果表明，檳榔籽乙醇提取物（AKEE）對DPPH自由基、羥基自由基、超氧根離子自由基的清除能力均強于BHT，均高于常用抗氧化劑BHT。同時，AKEE還表現(xiàn)出較高的還原力，并能有效延緩亞油酸自氧化反應(yīng)的速率。這表明檳榔籽乙醇提取物具有較好的抗氧化性，在食品或其它工業(yè)中有潛在的用途。

關(guān)鍵詞：檳榔籽；乙醇提取物；抗氧化；多酚

檳榔（Areca catectu L.），棕櫚科熱帶珍貴植物，為“四大南藥”之首，經(jīng)濟價值極高。檳榔全身是寶，其種子、果殼、花、花苞均可入藥[1]。研究表明，檳榔果可治腹瀉、水腫腳氣、小便不利等，同時具有殺蟲、抗疲勞、抗腫瘤等多種活性[2-7]。海南省萬寧市是我國最重要的檳榔產(chǎn)地，也有多家的檳榔初加工企業(yè)。據(jù)不完全統(tǒng)計，2010年萬寧市檳榔總產(chǎn)量25萬t，總產(chǎn)值達(dá)10億元，農(nóng)民檳榔人均年收入2 292元，占年均收入的39.4 %，檳榔已經(jīng)成為熱帶農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)[8]。目前檳榔加工中主要利用檳榔的果殼，而對檳榔籽（果仁）的利用率很低。大多數(shù)檳榔加工企業(yè)直接將檳榔籽丟棄，造成了資源的浪費。

大量的國內(nèi)外試驗證明，人體的許多疾病與體內(nèi)自由基的失衡密切相關(guān)[9-10]。體內(nèi)的羥基自由基、超氧根離子自由基可進(jìn)一步引發(fā)多種化學(xué)反應(yīng)，生成一系列化學(xué)物質(zhì)，從而使人體自由基失衡，最終導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生[11]。同時，羥基自由基等自由基也是導(dǎo)致油脂氧化酸敗的重要因素。因而，控制自由基的產(chǎn)生十分關(guān)鍵。目前常用的抗氧化劑多為化學(xué)合成，但因安全性問題其使用量和使用范圍受到越來越嚴(yán)格的限制。因此，尋找安全、高效、無毒的天然抗氧化劑成為研究的熱點。本試驗以檳榔籽為原料，研究檳榔籽乙醇提取物的抗氧化性，以期為檳榔籽的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料

檳榔籽由海南省萬寧市萬城鎮(zhèn)檳榔初加工基地提供。

1.2試劑及儀器

1.2.1試劑

甲醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、BHT、FeSO4、鐵氰化鉀、乙醇：天津科密歐公司；DPPH、Ferrozine試劑、沒食子酸：Sigma公司；甲醇、冰醋酸等試劑為色譜級；甲苯、二甲苯、苯并芘等試劑均為分析純。

1.2.2儀器

UV-1200紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；IFFM-E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：香港BUCHI公司；PYX-DHG-9101-25A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：廣東韶關(guān)科力實驗儀器有限公司；JB-3磁力攪拌器：上海智光儀器儀表有限公司。QP2010Plus型GC-MS（氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀）：島津（Shimadzu）；D-78532型臺式高速冷凍離心機：德國Httch公司。

1.3方法

1.3.1脫脂檳榔籽粉的制備

將檳榔籽切碎后于50℃下在鼓風(fēng)干燥箱中干燥4 h，粉碎，過20篩。然后在過篩的檳榔籽中按照1∶10的比例加入石油醚，振蕩提取2 h后，過濾，收集濾渣，反復(fù)脫脂3次。將脫脂后的檳榔籽再次粉碎，過60目篩，得到脫脂檳榔籽粉。

1.3.2檳榔籽粉75 %乙醇提取物的制備

稱取檳榔籽粉50 g，加入75 %（體積比）乙醇500 mL，超聲波預(yù)處理（40 Hz，35℃）10 min后，磁力攪拌提取2 h。過濾，收集濾液。濾渣再次加入75 %乙醇溶液，反復(fù)提取3次，合并濾液。將濾液在4℃、4 000 r/min下離心30 min，收集上清液，冷凍真空干燥后得到檳榔籽75 %乙醇提取物（areca kernel ethanol extraction，AKEE）。

1.3.3檳榔籽乙醇提取物抗氧化性的測定

將按照1.2.2制備的AKEE復(fù)溶于75 %乙醇中，分別配制成50、100、150、200和250 μg/mL的溶液，用于抗氧化試驗。

1.3.3.1 DPPH自由基的清除作用

參照文獻(xiàn)[12]的方法：將0.1 mL、不同濃度的AKEE （50 μg/mL～250 μg/mL）加入到1.4 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液中，再用95 %乙醇稀釋到3 mL，暗處放置30 min后，517 nm測吸光值，以BHT作對照，每組3個重復(fù)，一個空白。

DPPH清除率/% =（1-A樣品/A空白）×100

式中：A樣品為樣品（或?qū)φ眨┕艿奈庵担籄空白為空白管的吸光值。

1.3.3.2羥基自由基的清除作用

參照文獻(xiàn)[13]的方法：在1.34 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH7.4）中依次加入28 mmol/L的脫氧核糖溶液0.3 mL，28 mmol/L的雙氧水0.3 mL，2.5 mmol/L的三氯化鐵溶液30μL，1mmol/L的EDTA-Na20.3mL以及0.1 mL 100 μg/mL的樣品溶液。然后添加10 mmol/L抗壞血酸30 μL引發(fā)反應(yīng)，37℃水浴1 h，加入1 %的硫代巴比妥酸溶液0.3 mL，28 %的三氯乙酸30 μL，100℃，水浴20 min，冷卻后532 nm下測吸光值。模型管用水代替樣品。以BHT作對照。

羥基自由基的清除率/% =（1-A樣品/A模型）×100

式中：A樣品為樣品（或?qū)φ眨┕艿奈庵担籄模型為模型管的吸光值。

1.3.3.3對超氧根離子的清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[14]的方法：將AKEE溶解于0.1 mol/L、pH8.0的Tris-HCl緩沖液中配成不同濃度（50 μg/mL～ 250 μg/mL）的樣品溶液。取該樣品溶液0.1 mL，加入到3 mL、3 mmol/L的鄰苯三酚溶液中，混合均勻后，在320 nm下比色，每隔30 s記錄一次吸光值，共記錄10 min。模型管用水代替樣品，以BHT做對照。

超氧根離子的清除率/%=（1 - A樣品/A模型）×100

式中：A樣品為樣品管的吸光值；A模型為模型管的吸光值。

1.3.3.4 Fe2+絡(luò)合能力的測定

參照文獻(xiàn)[14]的方法：移取50μL、不同濃度的AKEE （50 μg/mL～250 μg/mL）于試管中，加入1 mmol/L的FeSO4溶液25 μL，5 mmol/L的Ferrozine試劑50 μL，室溫反應(yīng)10 min后，用甲醇定容到3 mL，在562 nm下測吸光值。模型管用甲醇代替樣品，用BHT作對照。

Fe2+絡(luò)合率/% =（1-A樣品/A模型）×100

式中：A樣品為樣品（或?qū)φ眨┕艿奈庵担籄模型為模型管的吸光值。

1.3.3.5還原能力測定

參照文獻(xiàn)[15]的方法：移取200 μL的AKEE （50 μg/mL～250 μg/mL）于試管中，加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6），1 mL 1 %的鐵氰化鉀溶液，混合后于50℃水浴加熱20 min，然后加入10 %的三氯乙酸1 mL，4 000 r/min常溫離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水以及0.1 %三氯化鐵400 μL，混勻后在700 nm測吸光值，用BHT作對照。

1.3.3.6抑制脂質(zhì)過氧化能力的測定

參照文獻(xiàn)[16]的方法，略有改進(jìn)。取3mL、10 mmol/L亞油酸溶液，加入100 μL AKEE（100 μg/mL），混勻后于37℃下暗反應(yīng)8 d，空白管不加樣品。每天吸取反應(yīng)液200 μL，加入10 mmol/L硫氰酸銨，300 μL、30 %氯化亞鐵，旋渦混合器充分混合，于500 nm測定其吸光值。用BHT作對照。

1.3.4數(shù)據(jù)處理

抗氧化試驗均重復(fù)3次，取平均值。采用軟件DPS 7.05進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1AKEE對DPPH·的清除能力

DPPH自由基已被廣泛應(yīng)用于測定植物提取物的抗氧化活性。檳榔籽75 %乙醇提取物（AKEE）在不同濃度下對DPPH·的清除能力見圖1。

圖1　AKEE對DPPH·的清除能力Fig.1 Scavening activity of AKEE on DPPH radical

如圖1所示，與BHT相比，在50 μg/mL～250 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，AKEE顯示出更強的清除能力。

2.2AKEE對·OH的清除能力

AKEE對·OH的清除能力見圖2。

圖2　AKEE對·OH的清除能力Fig.2 Scavening ability of AKEE on hydroxyl radical

目前，活性氧誘導(dǎo)的DNA損傷被認(rèn)為是機體老化的主要原因[8-9，13]。而·OH是已知的活性氧中對生物體毒性最強的一種自由基，它可以通過多種反應(yīng)破壞生物體的各種大分子，如蛋白質(zhì)、脂肪和DNA，特別是VB1和鳥嘌呤核苷[16]，對生物體造成很大程度的損傷。是機體內(nèi)最活躍的自由基之一，它是多種自由基合成的中間產(chǎn)物。如圖2所示，隨著濃度的增大，AKEE 和BHT對羥基自由基的清除能力也逐漸變大。而在150 μg/mL～250 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，AKEE顯示出更強的清除能力。

2.3AKEE對超氧根離子自由基（O2-·）的清除能力

AKEE對超氧根離子自由基（O2-·）的清除能力見圖3。

圖3　AKEE對O2-·的清除能力Fig.3 Scavening ability of AKEE on superoxide radical

O2-·是機體受損或代謝失衡時最先產(chǎn)生的自由基之一，O2-·會引發(fā)一系列化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生更多的自由基。因而O2-·既是機體氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，也是許多氧化反應(yīng)的引發(fā)物和底物。圖3的結(jié)果表明，AKEE具有一定的清除O2-·能力，且隨濃度的提高，其清除出能力也提高。

2.4AKEE的還原力

AKEE的還原力見圖4。

圖4　AKEE的還原力Fig.4 Reducing power of AKEE

抗氧化劑將鐵氰化鉀中的三價鐵還原為二價鐵離子，二價鐵離子進(jìn)一步生成普魯士蘭，其在700 nm處有最大吸收波長。因此在700 nm下的吸光值越高，表明該抗氧化劑的還原力越高，抗氧化性越強[16]。如圖4所示，AKEE與BHT表現(xiàn)出相似的還原力；但在50 μg/mL～ 250 μg/mL的范圍內(nèi)，二者的還原力并未隨濃度的增大而增強。

2.5AKEE對Fe2+的絡(luò)合能力

AKEE對Fe2+的絡(luò)合能力見圖5。

圖5　AKEE對Fe2+的絡(luò)合能力Fig.5 Chelating capacity of AKEE on ferrous ion

在生物體內(nèi)，F(xiàn)e2+不僅可催化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，還能與活性氧反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，從而破壞生物體的生物大分子。而生物體的抗氧化劑能夠絡(luò)合二價鐵離子而降低其損害。如圖5所示，在50μg/mL～250μg/mL的范圍內(nèi)，AKEE對Fe2+的絡(luò)合能力顯著地高于BHT，且隨濃度的升高，AKEE的對Fe2+的絡(luò)合能力相應(yīng)提高。

2.6 AKEE對亞油酸自氧化的抑制能力

AKEE對亞油酸自氧化的抑制能力見圖6。

圖6　AKEE對亞油酸自氧化的抑制能力Fig.6 The ihbition ability of AKEE on autoxidant of linoelic acid

脂質(zhì)過氧化是油脂中多不飽和脂肪酸側(cè)鏈與活性氧（ROS）氧化反應(yīng)形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（lipid peroxide，LPO）的過程。脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)、喪失食用和商用價值的重要原因之一。圖5表明，亞油酸的酸敗速度很快，在暗反應(yīng)3 d后，自氧化的速率呈幾何級數(shù)增長。而在測試的8 d內(nèi)，AKEE對亞油酸的自氧化反應(yīng)的抑制能力與BHT相近，可有效延緩亞油酸變質(zhì)。

3　結(jié)論與討論

機體新陳代謝所產(chǎn)生的自由基，是代謝過程中的副產(chǎn)物，其過量積累可造成機體損傷。因此，篩選具有清除自由基和脂質(zhì)過氧化抑制作用的功能因子是目前研究的重點。本實驗結(jié)果表明，檳榔籽乙醇提取物（AKEE）對DPPH自由基、羥基自由基、超氧根離子自由基具有較強的清除能力；同時表現(xiàn)出較高的還原力，一定的Fe2+絡(luò)合能力，并能有效延緩亞油酸自氧化反應(yīng)的速率。這表明檳榔籽乙醇提取物具有較好的抗氧化性。

檳榔籽是目前檳榔加工業(yè)中的副產(chǎn)物，價格低廉、來源豐富。因此，檳榔籽乙醇提取物是一種來源豐富、經(jīng)濟、前景良好的的抗氧化劑資源。

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Study on the Antioxidant of Ethanol Extraction from Areca Kernel

ZHANG Lu2，3，ZHENG Ya-jun1，2，LI Yan2，ZHANG You-lin1，*，ZHANG Run-guang1，ZHANG Yu-feng2
（1. College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，Shaanxi，China；2. Coconut Research Institute，Chinese Academy of Tropic Agriculture Science，Wenchang 571339，Hainan，China；3. College of Horticulture and Landscape Architecture，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Abstract：The areca kernel was dried，corssed and then extracted by 75 % ethanol aqueous. The antioxidant activity of the extraction from areca kernel by 75 % ethanol（AKEE）was studied through testing its scavenging activity on DPPH radical，hydroxyl radical，ABTS and superoxide radical. Besides，its reducing power，chelating capacity and inhibition of linoleic acid autoxidation were researched，too. Moreover，the polyphone composition of this extraction was also analyzed by RP-HPLC. Compared with BHT，the AKEE exhibited higher scavenging activity on DPPH·，·OH and O2-·，and showed higher reducing power. Results also showed that AKEE could effectively inhibit the autoxidation of linoleic acid. This meant that AKEE was a good nature antioxidant and had potential application in food or other industry.

Key words：areca kernel；ethanol extraction；antioxidant；polyphones

收稿日期：2015-12-18

*通信作者：張有林，教授，博士生導(dǎo)師。

作者簡介：張璐（1993—），男（漢），本科在讀，研究方向：園藝學(xué)。

基金項目：國家科技支撐項目（2012BAD31B03）；海南省重大科技項目（ZDZX2013011）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.001