酪蛋白酶解產物的結構特征研究

柳甜甜，王金水，*，高蕓芳，李曉偉，周曉配，賈峰（.河南工業大學生物工程學院，河南鄭州45000；.河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州45000）

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酪蛋白酶解產物的結構特征研究

柳甜甜1，王金水1，*，高蕓芳1，李曉偉2，周曉配1，賈峰1
（1.河南工業大學生物工程學院，河南鄭州450001；2.河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450001）

摘要：用超聲波對酪蛋白進行預處理之后，利用胰蛋白酶對其進行酶解，檢測酶解后產物的表面特征、粒度分布及二級結構等指標，探討酪蛋白酶解產物的結構特征變化特征。結果表明：用超聲波輔助處理后，酪蛋白酶解液的酶解產物與未采用超聲波輔助處理的結果相比，產物的粒度更小且分布均勻，酪蛋白表面的孔洞化和層片化更快，隨著酶解時間的延長，酪蛋白酶解產物顆粒的粒度變小，分子量分布更加均勻；酪蛋白酶解產物中β-轉角和無規則卷曲減少，而β-轉角的含量增加。結果表明超聲波輔助處理對酶解酪蛋白有很好的促進的作用。

關鍵詞：酪蛋白；酶解產物；二級結構；超聲波；傅里葉紅外光譜（FTIR）

酪蛋白（casein，CN）是牛乳中的主要蛋白質，分子質量大約為20 kDa～25 kDa，呈酸性，由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白等四類組分組成[1]，是一類含磷的蛋白質[2]，能夠協助參與核酸、三磷酸腺苷（ATP）等重要的代謝活動。但是由于這4種單體通過α-螺旋、β-折疊和β-轉角等蛋白質二級結構形成了緊密的酪蛋白空間結構，使其在人體內消化困難，且易過敏，這些因素限制了酪蛋白在食品領域的應用。然而，近年來在酪蛋白水解物中發現很多具有重要生理功能的多肽，如：阿片肽[3]、降血壓肽[4]、抗血栓肽、免疫促進肽[5]、促進礦物離子吸收肽等，而這些多肽大約在1 000 Da左右，容易被腸道吸收[3]。這使得酪蛋白的水解成為研究的熱點[6]。

目前，蛋白質的酶解改性是改善蛋白質功能特性及其應用范圍的一種有效方法[8]。胰蛋白酶用來水解酪蛋白的研究相對較多[5，9-10]，但主要集中在水解條件的優化[11]、水解度、水解率及酶解產物中可溶性氮、氨基氮及肽氮含量[8]等較表觀方面的研究，而對酪蛋白水解過程中蛋白質的空間構象的變化研究的相對較少。

本研究采用超聲波技術對酪蛋白進行預處理，然后對其進行酶解。以期研究結果能夠為酪蛋白酶解機制提供線索，為制備生物活性肽，呈味肽等新產品提供技術支撐，拓寬酪蛋白在食品和非食品領域的應用。

1　材料與方法

1.1材料

酪蛋白（蛋白含量82.84 %、水分11.96 %、灰分2.48 %）：河南省東方惠化工有限公司；胰蛋白酶（酶活1.13×105U/g）：美國Amresco公司；其它試劑均為分析純。

JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；LC1260高效液相色譜儀：美國Agilent公司；Quanta200掃描電子顯微鏡：美國FEI公司；BT-9300H激光粒度分布儀：丹東市百特儀器有限公司；WQF-510傅里葉紅外光譜儀：北京瑞利分析儀器公司。

1.2方法

1.2.1酪蛋白酶解的輔助條件及酶解條件

在室溫條件下，配置底物濃度為5 %酪蛋白懸浮液，調節至pH 8使其溶解，先將酪蛋白懸浮液置于超聲波細胞粉碎（25 kHz）機中，調整超聲波的輸出功率分別為160 W和400 W，設置超聲波處理時間為1 h，未經超聲波處理酪蛋白懸浮液為對照。

酪蛋白酶解的條件為：酪蛋白底物濃度5 %，酶解溫度40°C，胰蛋白酶酶用量2 500 U/g酪蛋白。酶解一定時間后，迅速沸水浴10 min滅酶，冷卻至室溫，4 000 r/min離心20 min得上清液。

酶解之后的懸浮液一部分直接測定粒度的分布；另一部分冷凍干燥，所得固體樣品分別用于分子量分布、表面結構測定和二級結構測定。

1.2.2酶解產物的粒度分布測定

粒度分布采用激光粒度分布儀進行測定，酶解液按1∶1000（質量比）用去離子水稀釋，具體方法參見蘇銀杰等的方法[12]。每個樣品平行采集3次，取平均圖譜。

1.2.3酶解產物的分子量分布測定

采用高效體積排阻色譜（HPSEC）檢測超聲波處理酪蛋白的分子量分布情況。具體方法與步驟參考王金水等方法[13]。

1.2.4酶解產物表面結構測定

采用掃描電子顯微鏡觀測酪蛋白及超聲波處理的酪蛋白樣品的表面結構。取適量的酪蛋白及處理樣品，按掃描電子顯微鏡的要求制樣，進行樣品的外觀掃描。

1.2.5酶解產物的二級結構測定

采用傅里葉紅外光譜（FTIR）測定超聲波輔助處理酪蛋白及酶解產物的二級結構。具體步驟如下：稱取固體樣品2 mg，加入200 mg溴化鉀充分研磨干燥，壓片，使用傅里變換葉紅外光譜儀進行400 cm-1～4 000 cm-1波數掃描。選取波數為1 600 cm-1～1 700 cm-1波譜圖做傅里葉去卷積和二階導數圖譜，采用Gausse函數進行多次擬合至殘差最小。

1.2.6數據分析

試驗指標的檢測個進行3組平行試驗，結果用平均值±標準偏差表示。結果通過SPSS統計分析軟件進行95 %和99 %水平方差分析檢驗。

2　結果與討論

2.1酪蛋白酶解產物懸液粒度分布特征

酪蛋白酶解液粒度分布及粒度分布累積含量見圖1。

圖1 A和B是未經超聲波輔助處理酪蛋白酶解的粒徑分布圖，從圖可以看出，未經酶解的酪蛋白粒徑分布范圍較寬，約為0.1 μm～70.0 μm。隨著酶解時間的延長，酪蛋白產物的粒度分布的峰值向左移動，表明隨著酶解時間的延長，酪蛋白酶解產物的粒徑逐漸變小；酶解10 min時，粒度分布曲線呈現雙峰模式，隨著酶解時間的延長，曲線逐漸變為單峰模式，表示粒徑分布逐漸均勻。圖1 C和D是160 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解的粒徑分布圖，從圖可以看出，酪蛋白酶解粒徑分布范圍相對較窄，約為0.2 μm～30.0 μm，隨著酶解時間的延長，酪蛋白酶解產物的粒度分布的峰值向左移動，累積含量曲線左移，且曲線由平緩逐漸變為陡立，表明隨著酶解反應的進行，酪蛋白酶解產物粒徑減小且分布集中。圖1 E和F是400 W超聲波輔助處理的酪蛋白粒徑分布圖，從圖可以看出，酪蛋白及酶解產物粒徑分布范圍相對較窄，約為0.1 μm～30.0 μm；與160 W輔助處理的酪蛋白酶解產物的粒度分布值相比，可以看出，400 W處理在酶解40 min時的粒度分布峰值更小，表明在同樣的酶解時間內，經過大功率預測處理的酪蛋白更加容易酶解。

利用超聲波輔助處理后酪蛋白酶解液粒度分布情況進行積分得表1。

圖1　酪蛋白酶解液粒度分布及粒度分布累積含量圖Fig.1 The chart of particle size distribution and the cumulative content of particle size distribution in the casein enzymolysis liquid

表1　超聲波輔助處理對酪蛋白酶解液粒度分布的影響Table 1 The influence of ultrasonic pretreatment on particle size distribution of casein enzymolysis products

續表1超聲波輔助處理對酪蛋白酶解液粒度分布的影響

Continue table 1 The influence of ultrasonic pretreatment on particle size distribution of casein enzymolysis products

注：D表示顆粒直徑，D（x）指一個樣品的累積粒度分布達到x %時所對應的粒徑；其中，D（50）表示中位徑；D（4，3）表示體積平均徑及D （3，2）表示表面積平均徑，兩數值越接近，表示顆粒形狀越規則，越接近于球形。

由表1可知，對于對照試驗，隨著酶解反應的進行，D（50）、D（90）、D（4，3）總體呈現下降趨勢，但各相鄰點之間變化不明顯。而經過超聲波（160 W和400 W）處理后的酪蛋白酶解產物分析表明，D（90）呈顯著下降趨勢（P < 0.05），表明在酶解過程中，經超聲波處理后的酪蛋白大顆粒物質更易被分解為小顆粒；與對照試驗結果相比，經超聲波（160 W和400 W）處理后，酪蛋白酶解產物D（50）、D（90）、D（100）、D（4，3）均有所下降。經超聲波處理后的酪蛋白經過為20、30 min的酶解，其酶解產物D（90）、D（100）明顯小于對照試驗（P < 0.01），且400 W處理明顯強于160 W處理（P < 0.01）。但當酶解時間到40 min～80 min時，超聲波處理不能夠顯著影響酶解產物粒徑的累積分布。D（4，3）、D （3，2）隨酶解時間的延長，呈下降趨勢，且比值越來越小，表明隨著酶解時間的延長，酶解產物在水中越來越接近于球形。

2.2酪蛋白酶解產物分子量分布特征

酪蛋白酶解產物分子量分布的積分換算見表2。

表2　超聲波處理對酪蛋白酶解產物分子量分布的影響Table 2 The inflDaence of ultrasonic pretreatment on molecular weight distribution of casein enzymolysis products

由表2可以看出，分子量>20 000 Da的多肽含量，隨著酶解時間延長而減少，而<1 000 Da的多肽含量逐漸增多，中間分子量的多肽，表現出動態變化，說明是中間過渡形態。對160和400 W超聲波輔助處理1 h后酪蛋白的酶解結果，經400 W超聲波輔助處理后酶解的小片段更多，則酶解效果更明顯。

2.3酪蛋白酶解產物表面結構特征

未超聲波輔助處理酪蛋白不同酶解時間后表面的結構、160 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解不同時間后表面的結構和400 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解不同時間后表面的結構結果分別見圖2～圖4。

圖2　未超聲波輔助處理酪蛋白不同酶解時間后表面的結構圖Fig.2 The surface structure of the same casein（without ultrasonic pretreated）at the different time of enzymolysis

圖3　160 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解不同時間后表面的結構圖Fig.3 The surface structure of the same casein（ultrasonic pretreated by 160 W）at the different time of enzymolysis

圖4　400 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解不同時間后表面的結構圖Fig.4 The surface structure of the same casein（ultrasonic pretreated by 400 W）at the different time of enzymolysis

未經超聲波輔助處理酪蛋白酶解過程中（10 min～80 min）蛋白的表面結構變化如圖2A-F，可以看出，酪蛋白酶解10 min時其表面就出現酶解的小孔，隨著酶解時間的延長，酶解的孔洞逐漸增大，到40 min時，酪蛋白的表面出現層疊狀，進而酶解之后，層片逐漸減小。表明酪蛋白的膠團表面逐步破碎。經160 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解過程（10 min～80 min）產物的表面結構變化如圖3 A～F所示，可以看出，與對照試驗相比，經160 W超聲波處理1 h后，酶解10 min～20 min時其表面酶解的小孔更加均勻，呈現“蜂窩狀”，到30 min時，酪蛋白的表面出現層疊狀，比未處理的提前出現層片結構，逐漸減小。表明酪蛋白經超聲波處理后，其酶解反應能更加深層次地進行。經400 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解過程（10 min～80 min）產物的表面結構變化如圖4A～F所示，與對照和160 W的試驗相比，經400 W超聲波輔助處理1 h后，酪蛋白酶解10 min時其表面就呈現“蜂窩狀”，到20 min時，酪蛋白中的酶解小孔變大，到30 min時，酪蛋白的表面出現層疊狀，到40 min時，酪蛋白酶解的膠團表面結構疏松，有利于酶解的立體化進行。

2.4酪蛋白酶解產物二級結構特征

酪蛋白及經超聲波后酶解產物的傅里葉變換紅外光譜檢測結果如圖5所示。

圖5　酪蛋白酶解產物傅里葉紅外光譜圖Fig.5 The Fourier infrared spectrum of casein enzymolysis products

經超聲波160W輔助處后與對照相比，在2000cm-1～2 400 cm-1處有明顯的變化。但是，對蛋白質二級結構分析和應用最為廣泛的是對酰胺Ⅰ帶（波數1 700 cm-1～1 600 cm-1）進行去卷積、二階導數擬合處理，且認為1 610cm-1～1640cm-1為β-折疊，1 640 cm-1～1 650 cm-1為無規則卷曲，1 650 cm-1～1 658 cm-1為α-螺旋，1 660cm-1～1700cm-1為β-轉角。

對未經超聲波和超聲波處理后的酪蛋白及其酶解產物的紅外光譜酰胺I帶（1 600 cm-1～1 700 cm-1）進行去卷積、二階導數擬合處理，并統計酪蛋白酶解產物二級結構含量，見表3。

表3　酪蛋白酶解產物二級結構含量統計表Table 3 The secondary structure of casein enzymolysis products

由表3可知，酪蛋白經胰蛋白酶酶解之后，α-螺旋含量均下降，α-螺旋/β-折疊也不同程度減小，酶解10 min時變化已經很明顯；與對照試驗相比，經160、400 W超聲波處理1 h后的酪蛋白，在經過同等酶解時間處理，其酶解產物中的α-螺旋/β-折疊有所下降，表明經超聲波輔助處理的酪蛋白，其酶解產物柔韌性增大。經160和400 W超聲預處理1 h后，在酶解20 min時，其產物中的α-螺旋/β-折疊分別為0.28、0.27，二者之間結果差異不顯著；但酶解40 min后，則其二者之間產物中的α-螺旋/β-折疊結果有顯著差異（0.29、0.45）。

3　結論

本試驗用超聲波對酪蛋白進行預處理之后，利用胰蛋白酶對其進行酶解，檢測酶解后產物的表面特征、粒度分布及二級結構等指標，結果表明，用超聲波輔助處理后，酪蛋白酶解液的酶解產物與未采用超聲波輔助處理的結果相比，產物的粒度更小且分布均勻，酪蛋白表面的孔洞化和層片化更快，隨著酶解時間的延長，酪蛋白酶解產物顆粒的粒度變小，分子量分布更加均勻；酪蛋白酶解產物中β-轉角和無規則卷曲減少，而β-轉角的含量增加。說明超聲波輔助處理對酶解酪蛋白有很好的促進的作用。

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Study on the Structural Characteristics of Casein Hydrolysis Products

LIU Tian-tian1，WANG Jin-shui1，*，GAO Yun-fang1，LI Xiao-wei2，ZHOU Xiao-pei1，JIA Feng1
（1. College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，Henan，China；2. School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，Henan，China）

Abstract：The characteristics of the product in the process of digestion with trypsin after the enzymolysis of the ultrasonic pretreated casein were studied. The particle size distribution of caseian were measured with laser particle size distribution analyzer，and the surface characteristics of casein were detected by the electronic scanning electron microscopy（SEM），and the secondary structure changes in casein were measured with Fourier infrared spectrum. The results showed that it was easy to make holes or layers in the dense surface structure of ultrasonic pretreated casein than the untreated casein. The larger casein particles changed into smaller one and molecular weight distribution became more uniform. These changes made the originally dense surface structure of casein to become relatively incompact and increase the specific surface area. These changes were conducivebook=15,ebook=22to the subsequent enzymolysis. The beta angle and random curl reduced as well as the contents of beta angle increased in casein after enzymolysis. The results showed that it had a good effect on the enzymatic hydrolysis of casein with ultrasonic assisted treatment.

Key words：casein；enzymatic hydrolysates；secondary structure；ultrasonic；Fourier transform infrared spectroscopy（FTIR）

收稿日期：2015-02-04

*通信作者：王金水（1964—），男（漢），教授，博士，研究方向：糧食生物技術。

作者簡介：柳甜甜（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：糧食生物技術。

基金項目：河南工業大學博士基金項目（2012BS013）；河南省教育廳科學技術研究重點項目（13A550166）；鄭州市普通科技攻關計劃項目（N2013G0077）；河南工業大學?；A研究重點培育基金（2013JCYJ05）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.004