低溫低壓法提取桑黃菌絲體活性多糖

李樂，馬瑤，李亭亭，慕雪盼，王苗，劉陶，馬小魁，*（.富平中學，陜西渭南7700；.藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室／西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，陜西師范大學生命科學學院，陜西西安7000）

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低溫低壓法提取桑黃菌絲體活性多糖

李樂1，馬瑤2，李亭亭2，慕雪盼2，王苗2，劉陶2，馬小魁2，*
（1.富平中學，陜西渭南711700；2.藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室／西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710100）

摘要：首次通過旋轉蒸發儀在低溫低壓條件下提取桑黃菌絲體活性多糖，并利用響應面法對提取條件進行了優化。在單因素試驗結果的基礎上，分別以多糖得率和其總抗氧化活性為響應值，使用Minitab 16軟件對提取時間、壓力、液料比進行了優化，并通過響應面優化器對同時獲得高活性高產率桑黃多糖的條件進行了優化。結果顯示，在提取時間、壓力和液料比分別為1.8 h、0.059 MPa和52.5∶1（mL/g）的最優提取條件下，從桑黃菌絲體中獲得多糖的得率和抗氧化活性（TEAC）分別可達到4.41%和6.33mM。證實低溫低壓法提取真菌活性多糖的方法是可行的。

關鍵詞：旋轉蒸發儀；低溫低壓法；響應面優化；多糖得率；抗氧化活性

桑黃又名鮑氏層孔菌（Phellinus igniarius），屬擔子菌亞門（Basidiomycota）、層菌綱（Hymenomycetes）、非褶菌目（Aphyllophorales）、銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）、針層孔菌屬（Phellinus）[1]，具有抗腫瘤[2-3]、抗氧化[4-7]、降血糖[8-9]、消炎[10-12]和增強免疫活性[13-15]等藥理作用。桑黃是在生物抗癌領域中國際公認的效果最佳的藥用菌，也是國際醫藥界與保健品行業抗癌產品生產的原料[16]，市場潛力巨大。但桑黃在自然界中很難形成子實體，并且人工栽培技術還不成熟，市場供應嚴重不足。多糖作為桑黃菌的一種非常重要的活性物質，具有非常好的藥效作用[17]。桑黃菌絲體多糖提取方法主要有熱水浸提法、超聲破碎法等。郭霞[18]等對利用熱水提取法、復合酶法、超聲波提取法等提取桑黃菌絲體多糖的提取條件進行了研究。但是，這些方法存在提取溫度高，物理破碎劇烈的缺點，從而導致獲得的多糖活性差，產率低。

響應面設計法（RSM）是采用多元二次回歸擬合方程以及多種統計方法分析多因素系統中最佳條件的數學統計方法[19]，是建立一個包括各因素的一次項、平方項和任何兩個因素之間的一級交互作用項的數學模型，也是目前國外較廣泛使用的優化方法，近年來在國內也日益受到重視[20-23]。在我們成功建立高效液體培養桑黃菌的基礎上[24-25]，本試驗通過旋轉蒸發儀建立了一種低溫低壓法提取桑黃菌絲體高活性多糖的方法，并通過RSM對其提取條件進行了優化。該試驗結果為大規模利用這一珍稀藥用資源提供了理論和技術基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種：桑黃（Phellinus sp.P0988），保藏于中國典型培養物保藏中心，編號為CCTCC NO：M 2012080。

RE-6000旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；JA2603B精密電子天平：上海精科儀器；Epoch超微量微孔板分光光度計：美國BioTek。

1.2方法

1.2.1工藝流程

桑黃菌種活化、發酵→發酵液→9 000 r/min離心15 min棄上清，取菌絲體→清水沖洗→過濾除去水分→低溫低壓法提取→收集提取液→濃縮、醇沉→冷凍干燥得到粗多糖

1.2.2桑黃菌絲體多糖提取得率和多糖抗氧化活性（TEAC）測定

多糖含量的測定：苯酚-硫酸法[26]，以葡萄糖為標準品，測得470 nm處標準曲線的線性回歸方程為：y = 0.001 9x + 0.006 4，R2= 0.990 4。

桑黃多糖得率計算：桑黃多糖得率/ %=桑黃多糖含量/提取菌絲量×100。

多糖抗氧化活性測定：使用總抗氧化能力檢測試劑盒，以Trolox為標準品，測得734 nm處標準曲線的線性回歸方程為：y = 0.140 3x + 0.028 9，R2= 0.996 4。

1.2.3單因素及響應面試驗設計

以旋轉蒸發儀為提取儀器，分別以提取時間、壓力和液料比3個因素進行單因素試驗設計。提取時間分別設定為1、2、3、4、5 h；提取壓力分別設定為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 MPa；液料比分別設定為：30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）。測定桑黃菌絲多糖得率及TEAC，每個試驗均設3個重復，結果取平均值。

根據單因素試驗結果，使用Minitab 16軟件，采用中心組合試驗設計（CCD）的方法分析壓力、液料比、和時間對響應值的影響，對試驗數據進行分析，擬合多元二次回歸方程模型，確定提取桑黃菌絲多糖的最佳工藝參數。多元二次回歸方程模型擬合的性質由R2表達，其統計學上的顯著性由P值檢驗。并以Minitab 16軟件的響應面優化器對同時獲得高產率和活性的多糖提取條件進行優化。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1提取時間對桑黃多糖得率和抗氧化活性的影響

以旋轉蒸發儀為提取儀器，分別設定壓力值為0.05 MPa、液料比為40∶1（mL/g）、提取溫度為60℃，研究提取時間分別為1、2、3、4、5 h時對多糖得率及抗氧化活性的影響，結果如圖1（A）所示。結果表明，當提取時間為2 h時，多糖得率和抗氧化活性均達到最大。隨著時間的增加，多糖得率降低，這是由于多糖處于一定溫度的時間越長，多糖受到的破壞越大。隨著時間的增加，抗氧化活性也降低，而這則是由于多糖得率降低造成的。

2.1.2提取壓力對桑黃多糖得率和抗氧化活性的影響

以旋轉蒸發儀為提取儀器，分別設定時間值為2h、液料比為40∶1（mL/g）、提取溫度為60℃，研究提取壓力分別為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 MPa時對多糖得率及抗氧化活性的影響，結果如圖1（B）所示。結果顯示，隨著壓力的增加，多糖得率和抗氧化活性均明顯增加，當壓力為0.05 MPa時，多糖得率和抗氧化活性均達到最大。隨著壓力的進一步增大，均有所降低，這是由于壓力過大會使多糖的結構遭到破壞，從而影響多糖得率，造成抗氧化活性也隨之降低，但抗氧化活性變化并不大，這是由于提取溫度相對較低，使得已獲得的多糖仍具有完整的結構。

2.1.3提取液料比對桑黃多糖得率和抗氧化活性的影響

以旋轉蒸發儀為提取儀器，分別設定時間值為2h、壓力為0.05 MPa、提取溫度為60℃，研究提取液料比分別為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）時對多糖得率及抗氧化活性的影響，結果如圖1（C）所示。結果顯示，隨著液料比的增加多糖得率明顯增加，抗氧化活性隨著多糖得率的變化而變化，當液料比為50∶1（mL/g）時，多糖得率和抗氧化活性均達到最大。隨著液料比的進一步增大，多糖得率明顯下降，這是由于液料比過大不利于多糖物質的溶出，但抗氧化活性變化不大，這是由于已溶出的多糖仍具有完整的結構。

單因素試驗結果表明，分別在提取時間為2 h，提取壓力為0.05 MPa，提取液料比為50∶1（mL/g）時，桑黃菌絲體多糖提取的產率和抗氧化活性最高。但各個單因素最優條件的簡單組合并不一定能獲得最高的試驗效果[10-12]，這還需要通過響應面設計方法進一步確定最優的提取條件。

圖1　提取時間、壓力、液料比對多糖得率和抗氧化活性（TEAC）的影響Fig.1 The effect of individual extraction time，extraction pressure，solvent-solid ratio on polysaccharide yield and TEAC

2.2響應面設計及結果

2.2.1響應面試驗設計

根據2.1的單因素試驗結果，以提取時間（X1）、提取壓力（X2）、提取液料比（X3）為主要因素，選取X1為1、2、3 h，X2為0.03、0.05、0.07 MPa，X3為40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）為因素的水平范圍，分別以多糖得率（Y1）和多糖抗氧化活性（Y2）為響應值，根據中心復合試驗（CCD）設計原理，設計三因素三水平試驗。各因素的低、中、高水平以-1、0、1為編碼設計試驗，試驗因素和水平的編碼如表1所示。CCD試驗設計及結果如表2所示。

表1　三因素三水平中心復合試驗因素水平編碼表Table 1 The central composite experiment factor level table of three factors and three levels

表2　CCD試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of CCD test

2.2.2以多糖得率為響應值的擬合回歸方程的方差分析

使用Minitab 16分析軟件對表2中Y1的試驗數據進行回歸系數的顯著性檢驗和ANOVA分析，分析結果見表3。

表3　以響應值為多糖得率擬合回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA analysis for regression equation using polysaccharide yield as response values

擬合多糖得率Y1與各自變量關系的多元二項式回歸方程模型如下：

Y1= 4.42 - 0.018X1+ 0.034X2+ 0.134X3- 0.542X12-0.022 3X22-0.062 3X32+0.04X1X2+0.005X1X3+0.017 5X2X3

式中：Y1為胞外多糖得率；X1、X2、X3分別為提取時間、提取壓力、提取液料比的編碼值。

以響應值為多糖得率擬合回歸方程的方差分析見表3。由方差分析得到模型的回歸系數為R2=0.985 1，說明方程模型與試驗數據的擬合度為98.51 %，誤差為1.49 %，調整后的R2adj=0.971 6，說明模型和實際擬合程度較好。P值用于檢驗各系數的顯著性，P值越小，相關系數的顯著性越大。由表3可知，各系數的P< 0.000 1，則此模型具有顯著性和統計學意義，而失擬檢測項（0.592>0.05）不顯著，則不顯著，說明回歸方程的擬合非常理想。各因素的交互作用P<0.000 1，說明各因素交互作用對多糖得率的影響顯著。

根據擬合方程，獲得最佳提取多糖產量的工藝參數為：提取時間2.03 h、壓力0.04 MPa、料液比60.2∶1 （mL/g）。此工藝參數預測多糖得率為4.47 %，對預測的工藝參數和結果以旋轉蒸發儀為提取儀器進行3次試驗驗證，取平均值，測得多糖得率為4.32 %，SD值為0.27，說明以多糖得率為響應值的擬合方程預測準確。

2.2.3以多糖抗氧化活性（TEAC）為響應值的擬合回歸方程的方差分析

使用Minitab 16分析軟件對表2中多糖抗氧化活性的試驗數據進行回歸系數的顯著性檢驗和ANOVA分析，分析結果見表4。

表4　以響應值為多糖抗氧化活性（TEAC）的擬合回歸方程的方差分析Table 4 ANOVA analysis for regression equation using TEAC as response value

擬合得到多糖抗氧化活性Y2與各自變量關系的多元二項式回歸方程模型如下：

Y2= 6.15-0.42X1+0.42X2+0.36X3-0.97X12-0.37X22-0.47X32+0.4X1X2+0.375X1X3+0.225X2X3

式中：Y2為多糖抗氧化活性；X1、X2、X3分別為提取時間、提取壓力、提取液料比的編碼值。

以響應值為多糖抗氧化活性（TEAC）的擬合回歸方程的方差分析見表4。由方差分析得到模型的回歸系數R2=0.977 7，說明方程模型與試驗數據的擬合度為97.77 %，誤差為2.23 %，調整后的R2adj=0.957 7，說明模型和實際擬合程度較好。P值檢驗各系數的顯著性，由表4可知，各系數的P<0.000 1，則此模型具有顯著性和統計學意義，失擬檢測項（0.681>0.05）不顯著，說明回歸方程的擬合非常理想。由方差分析得到各因素的交互作用P<0.000 1，說明各因素交互作用對多糖抗氧化活性影響顯著。

根據擬合方程，獲得較高的多糖抗氧化活性的提取工藝參數為：提取時間1.8 h、壓力0.063 MPa、料液比51.5∶1（mL/g）。此工藝參數預測得到的多糖抗氧化活性為6.37 mM，對預測的工藝參數和結果以旋轉蒸發儀為提取儀器進行3次試驗驗證，取平均值，測得多糖抗氧化活性為6.21 mM，SD值為±0.35，說明以多糖抗氧化活性為響應值的擬合方程預測準確。

2.3雙響應值優化

采用Minitab 16分析軟件優化器對同時獲得高產率和高活性的多糖提取條件進行進一步優化。優化結果如圖2所示。

圖2　響應優化器優化圖Fig.2 The optimization plot of response optimizer

當響應優化的合意性達到0.974 21時，說明優化結果合理。優化的最佳工藝參數為：提取時間1.8 h、壓力0.059 MPa、料液比52.5∶1（mL/g），預測多糖得率可達到4.37 %，抗氧化活性可達到6.35 mM。對預測的工藝參數和結果以旋轉蒸發儀為提取儀器進行3次試驗驗證，取平均值，測得多糖得率為4.41 %，SD值為±0.31，多糖抗氧化活性為6.33 mM，SD值為±0.26。說明對多糖得率和抗氧化活性的雙響應值優化的預測準確。

3　討論

本試驗建立了一種從液體培養獲得的桑黃菌絲體中提取桑黃活性多糖的新型提取工藝，即低溫低壓法。在本試驗操作中，首次采用旋轉蒸發儀作為提取儀器，集提取和濃縮為一體，并可以大量提取桑黃菌絲體多糖，為獲得大量及高活性的多糖成分提供了試驗方法。該方法與傳統提取方法相比，降低了提取溫度，并能在低壓環境下提取真菌菌絲體多糖。而且本方法在獲得高產量多糖的同時，可以最大限度的保護多糖結構，進而使獲得的多糖抗氧化活性達到較高水平，確保所得多糖為高活性多糖。

提取因素及水平對桑黃菌絲體的多糖得率和抗氧化活性都分別具有一定的影響。為了獲得高產量的活性多糖，本試驗在單因素試驗的基礎上采用Minitab 16分析軟件進行CCD試驗設計，對試驗結果先分別以多糖得率和多糖抗氧化能力作為響應值擬合多元二次回歸方程，并對其進行方差分析，結果顯示擬合方程非常理想。然后又同時以多糖得率和多糖抗氧化活性作為雙響應值進行優化，得到了同時獲得高產率和活性的最佳優化條件的工藝參數，即提取時間、壓力和液料比分別為1.8 h、0.059 MPa和52.5∶1（mL/g）。在此提取條件下，經過試驗驗證，提取的多糖得率和總抗氧化活性分別可達到4.41 %和6.33 mM。本研究對桑黃多糖的活性功能的進一步研究具有重要的現實意義。

參考文獻：

[1]戴玉成.藥用擔子菌－鮑氏孔菌(桑黃)的新認識[J].中草藥, 2003, 34(1):94－95

[2]車會蓮,盂繁岳,杜杰,等.桑黃提取物對腫瘤生長和細胞免疫功能的影響[J].中國公共衛生,2005,21(1):79-81

[3] Song Y S, Kim S H, Sa J H, et al. Anti-angiogenic, antioxidant and xanthine oxidase inhibition activities of the mushroom Phellinus linteus[J]. Journal of ethnopharmacology, 2003, 88(1): 113-116

[4] In-Hye Park, Shin-Kyo Chung et al. An Antioxidant Hispidin from the Mycelial Cultures of Phellinus linteus[J]. Archives of pharmacal research,2004, 27(6):615-618

[5]鄭立軍,沈業壽,季俊虬,等.桑黃胞內多糖的抗突變和抗氧化作用[J].癌變.畸變.突變, 2007, 18(6): 465-468

[6]張萬國,胡晉紅,蔡漆,等.桑黃抗大鼠肝纖維化與抗脂質過氧化[J].中成藥.2002,24(4):281-283

[7] Chang Z Q, Hwang M H, Rhee M H, et al. The in vitro anti-platelet, antioxidant and cellular immunity activity of Phellinus gilvus fractional extracts[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(2): 181-187

[8] Kim D H, Yang B K, Jeong S C, et al. Production of a hypoglycemic, extracellular polysaccharide from the submerged culture of the mushroom, Phellinus linteus[J]. Biotechnology letters, 2001, 23(7): 513-517

[9] Hwang H J, Kim S W, Lim J M, et al. Hypoglycemic effect of crude exopolysaccharides produced by a medicinal mushroom Phellinus baumii in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Lifesciences,2005, 76(26): 3069-3080

[10] Kim S H, Song Y S, Kim S K, et al. Anti-inflammatory and related pharmacological activities of the η-BuOH subfraction of mushroom Phellinus linteus[J]. Journal of ethnopharmacology,2004,93(1): 141-146

[11] Ajith T A,Jose N,Janardhanan K K. Amelioration of cisplatin induced nephrotoxicity in mice by ethyl acetateextract of a polypore fungus, Phellinus rimosus[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2002, 21(2): 213-217

[12] Kim G Y, Kim S H, Hwang S Y, et al. Oral administration of proteoglycan isolated from Phellinus linteus in the prevention and treatment of collagen-induced arthritis in mice[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2003, 26(6): 823-831

[13] Yuan C, Huang X, Cheng L, et al. Evaluation of antioxidant and immune activity of Phellinus ribis glucan in mice[J]. Food chemistry, 2009, 115(2): 581-584

[14]薛芹.桑黃抗腫瘤活性物質的提取及活性檢測[D].南京:南京農業大學, 2009

[15]宋柳徵,張佩.桑黃多糖對免疫細胞調節作用研究進展[J].中國現代醫生, 2010, 48(12):23-24

[16]劉紅錦,蔣寧,張蘇珍,等.桑黃人工培育研究進展[J].江西農業學報, 2011, 23(9): 1661-1670

[17] Leung P H, Zhang Q X, Wu J Y. Mycelium cultivation, chemical composition and antitumour activity of a Tolypocladium sp. fungus isolated from wild Cordyceps sinensis[J]. Journal of applied microbiology, 2006, 101(2): 275-283

[18]郭霞,鄒祥,孫敏.桑黃菌絲體多糖提取方法比較及優化研究[J].食用菌,2009(3):62-64

[19]馬小魁,江華,李峻志,等.梨形馬勃產胞外多糖發酵條件的響應面設計法優化[J].浙江大學學報(農業與生命科學版), 2013, 39(5): 481-488

[20]劉麗麗,張建新,王娜,等.響應面分析法優化光皮木瓜總酚醇提工藝的研究[J].中國釀造, 2009, 28(2): 76-79

[21]凌慶枝,高莉莉,袁懷波,等.用響應面分析法優化桑葉水溶性多糖得提取工藝[J].蠶業科學, 2009, 35(3): 666-670

[22]劉云,胡芳,王志成,等.響應面分析法優化油菜籽類胡蘿卜素的提取工藝[J].食品科技, 2009, 34(12): 108-112

[23]劉軍海,黃寶旭,蔣德超.響應面分析法優化艾葉多糖提取工藝研究[J].食品科學, 2009, 30(2): 114-118

[24] Ma X K, Zhang H, Fam H. Influence of rutin, FeSO4, Tween 80, aspartate and complex vitamins on synthesis of fungal exopolysaccharide[J]. Carbohydrate polymers, 2013, 92(2): 1188-1196

[25] Ma X, Zhang H, Peterson E C, et al. Enhancing exopolysaccharide antioxidant formation and yield from Phellinus species through medium optimization studies[J]. Carbohydrate polymers, 2014, 107 (8): 214-220

[26] Ma X, Ruan Q, Zhang H, et al. Developing a high-throughput microassay for large samples of fungal polysaccharides[J]. Analytical Methods, 2013, 5(17): 4310-4316

Extraction of Active Polysaccharide from Phellinus species by A Low Temperature and Pressure Method

LI Le1，MA Yao2，LI Ting-ting2，MU Xue-pan2，WANG Miao2，LIU Tao2，MA Xiao-kui2，*
（1. Fu Ping High School，Weinan，711700，Shaanxi，China；2. Key Laboratory of Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry，Ministry of Education/National Engineering Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drugs in Northwest of China，College of Life Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710100，Shaanxi，China）

Abstract：The crude polysaccharide with antioxidant activity was firstly extracted from mycelia of Phellinus sp. using a rotary evaporation apparatus under low temperature and low pressure conditions. The extraction conditions including extraction time，pressure and solvent -solid ratio were optimized through response surface method（RSM），in which the individual yield and total antioxidant activity of polysaccharide were chosen as response values. Based on the results of RSM experiments，the response optimizer was further used to simultaneously get high yield and high activity of polysaccharide during extraction. Results showed that the optimum extraction conditions were extraction time 1.8 h，pressure 0.059 MPa，solvent-solid ratio 52.5∶1（mL/g），respectively. The polysaccharide yield and Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity（TEAC）reached 4.41 % and 6.33 mM，respectively，under optimum extraction conditions. A new feasible extracting method for crude polysaccharide from mycelia of Phellinus sp. with high yield and high total antioxidant activity has been developed just using a rotary evaporation apparatus.

Key words：the rotary evaporation apparatus；low temperature and pressure method；response surface method；polysaccharide yield，total antioxidant activity

收稿日期：2015-03-03

*通信作者

作者簡介：李樂（1988—），女（漢），碩士，研究方向：微生物技術制藥。

基金項目：陜西省特種資源的開發利用（693102）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.012