糞產堿桿菌D-氨基酰化酶的分離純化及發酵條件優化

陶　金，倪孟祥

(中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009)

?

糞產堿桿菌D-氨基酰化酶的分離純化及發酵條件優化

陶金，倪孟祥

(中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009)

摘要：采用熱激法將含糞產堿桿菌D-氨基酰化酶基因載體的質粒導入大腸桿菌，篩選重組子，對該工程菌產生的D-氨基酰化酶用Ni2+柱進行分離純化；通過單因素實驗優化D-氨基酰化酶的發酵條件。結果表明，純化后的D-氨基酰化酶比活力為456.71 U·mg-1，純化回收率為50%，純化倍數為12.4倍；最佳發酵條件為：37 ℃通氣培養至菌體濃度OD600值為0.6時，加入0.5 mmol·L-1誘導劑IPTG誘導5 h，在此條件下，D-氨基酰化酶酶活力為90.9 U·mL-1。

關鍵詞：D-氨基酰化酶；糞產堿桿菌；分離純化；發酵條件；優化

隨著科技的進步和分析方法的發展，人們相繼在動物、植物和微生物中發現了多種D-氨基酸，這些D-氨基酸在各領域中有著極其重要的作用[1]，如在醫藥領域被用來制備具有生物活性的多肽、半合成抗生素、酶抑制劑等藥物；在農業領域被用來合成低毒高效、無公害且易被生物降解的殺蟲劑；在食品添加劑領域被用作甜味劑合成的關鍵中間體[2-6]。D-氨基酸可通過D/L-氨基酸消旋體拆分、不對稱化學合成法、發酵法、酶法合成[7]。其中酶法合成D-氨基酸以高效、快速、低成本、易于大規模生產等特點得到廣泛應用[8]。研究發現，自然界中有多種酶可用于D-氨基酸的生產，如：N-酰基-D-氨基酸酰胺水解酶(D-氨基酰化酶)、N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶、D-乙內酰脲酶、D-氨基酸酰胺酶、氨基酸氧化酶、蛋白酶、D-氨基酸氨基轉移酶[1]。其中D-氨基酰化酶是一類專一性水解酶，它可以通過水解N-酰基-D-氨基酸得到高純度的D-氨基酸，所以利用D-氨基酰化酶來生產D-氨基酸逐漸成為熱點[9]。自從1952年科學家首次從土壤微生物中分離得到D-氨基酰化酶以來，目前已從糞產堿桿菌(Alcaligenes)、假單胞菌(Pseudomonas)、鏈霉菌(Streptomyces)、貪噬菌(Variovorax)、木霉菌(Trichoderma)和小細菌屬(Micro-bacterium natoriense)等菌屬中分離得到了D-氨基酰化酶[10]。作者在此將糞產堿桿菌D-氨基酰化酶基因導入大腸桿菌進行原核表達，再對該工程菌產生的D-氨基酰化酶進行分離純化，并通過單因素實驗對D-氨基酰化酶的發酵條件進行初步優化，擬為D-氨基酰化酶的大規模工業化生產奠定基礎。

1實驗

1.1菌種、試劑與儀器

菌種E.coliBL21(DE3)，自行保存。含糞產堿桿菌D-氨基酰化酶基因的重組質粒pET22b由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，宿主菌為Top10；氨芐西林(Amp)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、質粒小量提取試劑盒，上海生工生物工程有限公司；其它試劑均為分析純或色譜純。

EPS-200型數顯式穩壓恒流電泳儀，上海天能科技有限公司；Allegra25R型高速冷凍離心機，美國Beckman公司；H1650-W型臺式高速離心機，湘儀離心機儀器有限公司；電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司；HA-300MIT型全自動高壓蒸汽滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；XO-650型超聲波細胞破碎儀，南京先歐儀器制造有限公司；HL-2S型恒流泵，上海青浦滬西儀器廠。

1.2培養基

LB培養基(g·L-1)：酵母浸粉5，蛋白胨10，氯化鈉10，pH值7.0。

1.3方法

1.3.1D-氨基酰化酶表達載體的轉化

將含有糞產堿桿菌D-氨基酰化酶基因的表達載體pET22b從宿主菌Top10中提取出來，并將表達載體熱激轉化到E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，Amp抗性平板篩選，得到重組菌。

1.3.2D-氨基酰化酶的誘導表達

挑選平板上重組菌的單菌落，接種于1 mL含100 mg·L-1Amp的LB培養基中于37 ℃培養過夜(約10～12 h)。取上述1 mL菌液接入100 mL含100 mg·L-1Amp的LB培養基中于37 ℃、220 r·min-1振蕩培養至OD600值約為0.6時，加入誘導劑IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，于37 ℃、220 r·min-1振蕩培養3 h后進行SDS-PAGE分析。

1.3.3D-氨基酰化酶可溶性分析

取誘導后菌液在4 ℃、4 000 r·min-1離心10 min，收集菌體沉淀稱量濕重，按每克10 mL加入磷酸緩沖液，吹打混勻后于冰浴中超聲破碎(破碎條件：輸出功率300 W、破碎時間5 s、間隔時間5 s、次數200)。將懸浮液在4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液與沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.3.4D-氨基酰化酶的Ni2+柱純化

超聲破碎后的上清液用0.22 μm濾膜過濾后收集濾液，進行Ni2+柱層析。將管路系統中氣泡完全排出，按照上柱注意事項將柱子連接至純化系統中。用10 BV去離子水沖洗柱子，然后用10 BV的磷酸緩沖液平衡柱子，流速均為1 mL·min-1。取粗酶液上柱，流速減半。用10 BV的含低濃度咪唑的磷酸緩沖液洗柱子，洗去未掛柱的雜蛋白。用不同梯度的含高濃度咪唑的磷酸緩沖液梯度洗脫，收集洗脫液，備用。洗脫后，依次用10 BV的結合緩沖液、10 BV的去離子水洗柱子，再用5 BV的20%乙醇平衡柱子，于4 ℃保存。將不同梯度的洗脫液進行SDS-PAGE分析，將含有目的蛋白的洗脫液超濾脫鹽得到純酶。

1.3.5蛋白含量的測定

以牛血清白蛋白(BSA)標準液繪制標準曲線，用紫外分光光度法測定蛋白含量[11]。

1.3.6D-氨基酰化酶酶活力測定

分別取D-蛋氨酸母液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于試管中，用去離子水補足至1 mL，各加入1 mL醋酸鈉-醋酸緩沖液和1 mL茚三酮溶液，充分混勻后于沸水浴中放置15 min，自來水冷卻后靜置5 min，再加入3 mL 60%乙醇稀釋，搖勻后測定A570值并繪制標準曲線。

取粗酶液200 μL于1.5 mL EP管中，依次加入700 μL Tris-HCl溶液、100 μLN-乙酰-D-蛋氨酸溶液，使酶液稀釋5倍，終體積為1 mL；取純化后酶液25 μL于1.5 mL EP管中，加入875 μL Tris-HCl溶液、100 μLN-乙酰-D-蛋氨酸溶液，將酶液稀釋40倍，終體積為1 mL；對照為1 mL Tris-HCl溶液。將上述溶液于37 ℃水浴中反應30 min，室溫下于12 000 r·min-1離心5 min。取1 mL反應液于試管中，加入1 mL醋酸鈉-醋酸緩沖液和1 mL茚三酮溶液，充分混勻后于沸水浴中放置15 min，自來水冷卻，靜置5 min。再加入3 mL 60%乙醇稀釋，搖勻后測定A570值。

酶活定義：在上述條件下，1 min 內生成1 μmol D-蛋氨酸所需酶量定義為一個酶活單位(U)。

1.3.7發酵條件優化

通過單因素實驗考察IPTG濃度、誘導時機、誘導時間對酶活力的影響，以優化D-氨基酰化酶的發酵條件[12]。

2結果與討論

2.1D-氨基酰化酶的誘導表達

D-氨基酰化酶的分子量為55 kDa，His標簽的分子量為3 kDa，所以表達的蛋白分子量約為58 kDa。重組菌經誘導后，用10%的SDS-PAGE進行檢測，結果如圖1所示。

M.蛋白質標記　1～5.IPTG誘導3 h的pET22b　6.pET22b

從圖1可以看出，重組菌經過IPTG 3 h的誘導后，在約58 kDa處出現明顯蛋白表達條帶，而未經IPTG誘導的則沒有蛋白表達條帶。

2.2D-氨基酰化酶的可溶性分析

將IPTG誘導后的重組菌破胞，離心后分別收集上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析，結果如圖2所示。

M.蛋白質標記　1.上清液　2.沉淀

從圖2可以看出，上清液中的蛋白含量比沉淀中的蛋白含量少，因此D-氨基酰化酶的可溶性不高。

2.3D-氨基酰化酶的Ni2+柱純化

IPTG誘導表達的D-氨基酰化酶基因的pET22b載體上有His標簽，可用Ni2+柱純化。將1 L粗酶液經Ni2+柱純化，再用不同濃度的咪唑溶液洗脫，結果發現，用100 mmol·L-1咪唑溶液洗脫可以得到較高純度的目的蛋白，如圖3所示。D-氨基酰化酶的純化結果見表1。

M.蛋白質標記　1～2.PBS緩沖液洗脫液　3～4.50 mmol·L-1

表1

D-氨基酰化酶的純化結果

Tab.1

Purification results of D-aminoacylase

從表1可知，1 L發酵液經Ni2+柱純化后，可獲得純化目的蛋白15.81 mg，以N-乙酰-D-蛋氨酸為底物，在37 ℃測得的總活力為7 220.9 U，比活力為456.71 U·mg-1，是純化前的12.4倍。

2.4重組菌發酵條件優化

2.4.1IPTG濃度對酶活力的影響(圖4)

圖4　IPTG濃度對酶活力的影響

由圖4可以看出，0.1 mmol·L-1的IPTG誘導時菌體濃度和酶活力都較小；隨著IPTG濃度的增大，菌體濃度和酶活力均逐漸增大；當IPTG濃度為0.5 mmol·L-1時，菌體濃度和酶活力都達到最大；但由于IPTG本身對E.coli細胞具有毒性，隨著IPTG濃度的進一步增大，菌體濃度和酶活力均減小。因此，最佳IPTG濃度為0.5 mmol·L-1。

2.4.2誘導時機對酶活力的影響(圖5)

圖5　誘導時機對酶活力的影響

由圖5可以看出，當菌體濃度OD600值達到0.6時加入IPTG，此時表達的D-氨基酰化酶的酶活力最大，為90.1 U·mL-1；IPTG加入過早會使菌體生長不完全，蛋白表達不充分；IPTG加入過晚會使菌體過度生長，培養基養分不足以供應蛋白的表達。因此，最佳誘導時機為菌體濃度OD600值達到0.6時加入IPTG。

2.4.3誘導時間對酶活力的影響(圖6)

圖6　誘導時間對酶活力的影響

由圖6可以看出，當IPTG誘導1～5 h時，菌體濃度和酶活力都逐漸增大；誘導5～24 h時，菌體濃度仍逐漸增大，酶活力卻逐漸減小。這是由于，誘導時間延長，后期菌體大量死亡，導致酶活力減小；在IPTG誘導5 h時表達的D-氨基酰化酶的酶活力最大，為90.9 U·mL-1。因此，最佳誘導時間為5 h。

3結論

將糞產堿桿菌的D-氨基酰化酶基因插入到pET22b表達載體上，以E.coliBL21(DE3)為宿主菌，IPTG誘導表達D-氨基酰化酶。D-氨基酰化酶的可溶性不高，經Ni2+柱純化后的比活力為456.71 U·mg-1，是粗酶的12.4倍。重組菌的最佳發酵條件為：37 ℃通氣培養至菌體濃度OD600值為0.6時，加入0.5 mmol·L-1誘導劑IPTG誘導5 h，在此條件下，D-氨基酰化酶的酶活力為90.9 U·mL-1。該研究為今后D-氨基酰化酶的大規模工業化生產奠定了基礎。

參考文獻：

[1]WAKAYAMA M,YOSHIMUNE K,HIROSE Y,et al.Production of D-amino acids byN-acyl-D-amino acid amidohydrolase and its structure and function[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic,2003,23(2-6):71-85.

[2]SHINADA T,ISHIDA T,HAYASHI K,et al.Synthesis of leucine-enkephalin analogs containing α-amino squaric acid[J].Tetrahedron Letters,2007,48(43)：7614-7617.

[3]YOKO N,MASATOSHI H,YUTAKA I,et al.The presence of high concentrations of free D-amino acids in human saliva[J].Life Sciences,2006,78(15):1677-1681.

[4]CIACCIO C,TUNDO G R,GRASSO G,et al.Somatostatin：A novel substrate and a modulator of insulin-degrading enzyme activity[J].Journal of Molecular Biology,2009,385(5):1556-1567.

[5]MIYOSHI Y,KOGA R,OYAMA T,et al.HPLC Analysis of naturally occurring free D-amino acids in mammals[J].Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,2012,69(8):42-49.

[6]CAVA F,LAM H,de PEDRO M A,et al.Emerging knowledge of regulatory roles of D-amino acids in bacteria[J].Cellular & Molecular Life Sciences,2011,68(5):817-831.

[7]韋萍.D-氨基酸的制備研究[D].南京:南京工業大學,2002.

[8]于平.生物轉化和手性拆分技術制備D-氨基酸研究進展[J].生物學通報,2005,40(9):3-5.

[9]鄭文賓,鄭仁朝,鄭裕國.D-氨基酰化酶的研究進展[J].基因組學與應用生物學,2014，33(3):704-708.

[10]LIU J,ASANO Y，ILOMA K，et al.Purification,characterization,and primary structure of a novelN-acyl-D-amino acid am-idohydrolase fromMicrobacteriumnatorienseTNJL143-2[J].Journal of Bioscience & Bioengineering,2012,114(4):391-397.

[11]SWARTZ J R.Advances inEscherichiacoliproduction of therapeutic proteins[J].Current Opinion in Biotechnology,2001,12(2):195-201.

[12]侯欣彤.來源于AlcaligenesA-6的D-氨基酰化酶基因工程菌的構建與酶學性質的研究[D].長春:吉林大學,2014.

Isolation,Purification and Fermentation Conditions Optimization ofAlcaligenesFaecalisD-Aminoacylase

TAO Jin,NI Meng-xiang

(SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)

Abstract：Heat shock method was applied to transform recombinant plasmid containing Alcaligenes faecalis D-aminoacylase gene into Escherichia coli,and then the recombinants were screened.D-Aminoacylase from the engineering bacteria was isolated and purified by Ni-NTA affinity chromatography.The fermentation conditions of D-aminoacylase were optimized by a single factor experiment.The results showed that D-aminoacylase was purified up to 12.4 times with a recovery rate of 50%,and its specific activity was 456.71 U·mg-1.The optimum fermentation conditions were as follows:after aerobic cultured at 37 ℃ to OD600value of 0.6,induced 5 h with addition of 0.5 mmol·L-1IPTG.Under above conditions,D-aminoacylase activity was 90.9 U·mL-1.

Keywords：D-aminoacylase;Alcaligenes faecalis;isolation and purification;fermentation condition;optimization

中圖分類號：TQ 920Q 55

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)04-0055-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.014

作者簡介：陶金(1989-)，男，遼寧撫順人，碩士研究生，研究方向：微生物與生化藥學，E-mail：taojincpu@126.com；通訊作者：倪孟祥，副教授，E-mail：nimx_2000@aliyun.com。

收稿日期：2015-12-30