益氣活血中藥對脂多糖致急性肺損傷大鼠的防治作用

秦麗　王毓國　李敏　竇永起

100853 北京，中國人民解放軍總醫院中醫科[秦麗(碩士研究生)、王毓國、李敏、竇永起]

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益氣活血中藥對脂多糖致急性肺損傷大鼠的防治作用

秦麗王毓國李敏竇永起

100853 北京，中國人民解放軍總醫院中醫科[秦麗(碩士研究生)、王毓國、李敏、竇永起]

【摘要】目的觀察益氣活血中藥對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)大鼠的防治作用，并初步探討其作用機制。方法SD雄性大鼠40只，隨機分成正常對照組、模型對照組、地塞米松組、益氣活血中藥治療組、益氣活血中藥防治結合組，每組8只；除正常對照組行氣管內滴注生理鹽水，其余各組均滴注LPS(5 mg/kg)制備ALI大鼠模型；造模前后各3天干預組予以2 mL相應藥物(益氣活血中藥0.59 g/mL；地塞米松5 mg/kg)，其余組予以等量的生理鹽水灌胃。觀察大鼠的呼吸、精神等一般活動；于末次灌胃給藥2小時后處死大鼠，測定大鼠肺濕重/干重(W/D)比值，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中總蛋白含量，及光鏡下觀察肺組織病理學改變。結果LPS造模組大鼠肺W/D比值、BALF中蛋白濃度及肺組織中腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6含量均高于正常對照組(P<0.01)，且模型對照組高于地塞米松組和中藥治療組、中藥防治結合組(P<0.05)，治療組高于防治組(P<0.05，P<0.01)；地塞米松組W/D比值及肺組織中TNF-α、IL-1β含量與中藥防治組無明顯差異(P>0.05)。結論益氣活血中藥能夠降低LPS致ALI大鼠BALF中蛋白含量及肺組織中炎癥因子的含量，減輕肺水腫和肺組織的病理損傷，起到防治急性肺損傷的作用。

【關鍵詞】益氣活血中藥；急性肺損傷；脂多糖

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是感染、創傷等病因下出現的以進行性呼吸困難、頑固性低氧血癥和肺水腫為主要表現的臨床綜合征。ARDS是ALI的嚴重階段，為臨床常見的急危重癥，由于其發病機制復雜，治療效果不佳，其病死率仍然居高不下，平均病死率高達50%以上[1]。課題組既往研究[2]表明益氣活血中藥通過促進血液中血管活性多肽降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)的合成與釋放、抑制血管收縮因子內皮素-1(endothelin，ET-1)的生成及釋放，從而擴張血管、減輕肺水腫、改善肺循環，發揮對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致ALI大鼠的防護作用。本研究通過益氣活血中藥干預LPS誘導的ALI大鼠，觀察支氣管肺泡灌洗液中蛋白和肺組織中炎癥因子的變化，初步探討益氣活血法防治ALI的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

選用兩月齡健康清潔級SD雄性大鼠40只，體質量為(200±20) g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(軍)：2012-0004。

1.2藥物制備

益氣活血中藥由生黃芪和丹參組成，兩者用量比例為2∶1，中藥材由解放軍總醫院中藥房采購及鑒定，經過浸泡、煎煮和過濾后，在恒溫水浴鍋(60℃)中濃縮成含生藥量為0.59 g/mL的藥液(按大鼠與人體體表面積換算公式計算[3])。

1.3主要試劑和儀器

脂多糖，購自Sigma公司，批號：L2880；戊巴比妥鈉，購自Germany公司，批號：K2208；BCA法蛋白定量試劑盒，購自北京普利萊公司，批號：201308；大鼠腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor,TNF)-α(Andygene，批號：HTLN30633)、白介素(interleukin,IL)-1β(Andygene，批號：HTCL30418)、IL-6(Andygene，批號：HTLC30649)ELISA試劑盒。

多功能酶標儀(VICTOR X5)，購自PerkinElmer有限公司；旋轉蒸發器(RE53CS)，購自上海亞榮生化儀器廠；切片機(萊卡2016)，購自上海萊卡儀器有限公司；包埋機，購自湖北孝感亞鵬儀器廠；臺式冷凍離心機(1-15K)，購自SIGMA公司；電熱恒溫箱(DHG-9240A)，購自北京陸希科技有限公司。

1.4動物分組及處理方式

SD雄性大鼠40只，隨機分成正常對照組、模型對照組、地塞米松組、益氣活血中藥治療組、益氣活血中藥防治結合組，每組8只。中藥防治結合組(簡稱中藥防治組)大鼠在造模前3天每天予以益氣活血中藥2 mL灌胃(1次/d，含生藥量0.59 g/mL)，其余組大鼠每天予以同體積的生理鹽水。在造模成功后，益氣活血中藥治療組(簡稱中藥治療組)和中藥防治組大鼠每天予以2 mL益氣活血中藥(0.59 g/mL)灌胃，地塞米松組大鼠每天予以2 mL地塞米松溶液(5 mg/kg)灌胃，正常對照組和模型對照組大鼠每天予以等量的生理鹽水灌胃，1次/d，連續給藥3天。

1.5制備ALI大鼠模型

采用LPS暴露式氣管滴注方法制備ALI模型[4]。除正常對照組外，其余各組均給予氣管內滴注LPS溶液(5 mg/kg)。造模過程：無菌環境下，采用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射進行大鼠麻醉，固定大鼠于仰臥位，正中切開頸部組織，使氣管暴露，用1 mL注射器由氣管向肺方向滴注LPS溶液，而后將大鼠直立、旋轉并左右搖晃，使LPS溶液在肺內均勻分布，從而建立內毒素性急性肺損傷大鼠模型。正常對照組大鼠按上述方法向氣管滴入等量的生理鹽水。

1.6標本取材與觀測指標

1.6.1一般情況造模后觀察各組大鼠的呼吸頻率、自主活動、精神狀況和唇爪顏色等情況。

1.6.2大鼠支氣管肺泡灌洗液中總蛋白濃度的測定所有大鼠在造模灌胃后第3天麻醉稱重，處死后剪開胸部和頸部皮膚，暴露胸腔；結扎大鼠右主支氣管后，在主氣管上插入導管至下端分叉處，注入磷酸鹽緩沖液2 mL進行左肺灌洗，反復3次，總回收量約為5.5 mL；將收集的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)進行4℃離心，3000 rpm，15分鐘，取上清液。采用BCA法檢測BALF中總蛋白濃度，操作嚴格按試劑盒說明書進行。反應終止后，用酶標儀562 nm觀測密度(OD)值，繪制標準曲線，用Excel擬合曲線計算蛋白濃度。

1.6.3大鼠肺濕重/干重(W/D)比值取右肺上葉組織，用濾紙吸走表面附著的水分與血漬，稱得濕重(wet weight，W)后將其置于60℃恒溫箱中72小時至重量不再改變，取出稱得干重(dry weight，D)，計算W/D比值。

1.6.4大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的測定稱取右肺中葉，以每100 mg組織加入生理鹽水1 mL，在冰上用勻漿器勻漿，4℃、 3000 rpm、 15分鐘，低溫離心取上清液，采用雙抗體夾心酶聯免疫(ELISA)法，嚴格按試劑盒說明書方法進行TNF-α、IL-1β、IL-6因子濃度的檢測。反應終止后選擇 450 nm波長，檢測相應的OD值，計算相應的濃度。

1.6.5肺組織大體情況和病理學觀察 取材時肉眼觀察雙側肺組織表面色澤、包膜完整性、水腫情況及有無出血點等。并取右肺下葉組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定48小時后，進行脫水、透明和石蠟包埋并作4 μm厚切片，然后進行蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察大鼠肺組織的病理形態改變。1.7統計學處理

2結果

2.1各組大鼠一般狀況

正常對照組大鼠生理鹽水造模及麻醉緩解后呼吸尚平穩，對外界刺激反應正常。而氣管滴注LPS造模大鼠，2小時內呼吸急促并發出喘鳴音，且精神萎靡、反應遲鈍、自主活動減少、四肢和口唇發紺；隨后至4小時內模型對照組大鼠精神仍然萎靡、無進水進食，而防治組大鼠呼吸平穩、自主活動開始恢復。

2.2大體觀察及光鏡下觀察各組大鼠肺組織

正常對照組大鼠雙側肺組織色澤呈淡粉紅色，包膜完整、彈性好，表面無出血點，胸腔內無液體滲出；光鏡下顯示肺組織結構正常，肺泡結構清晰完整，肺泡間隔無水腫，肺泡腔內有滲出液或炎性細胞。見圖1A。

模型對照組雙側肺葉呈暗紅色，充血水腫明顯，表面可見紫紅色斑塊或點片狀出血，胸腔內有滲出液；光鏡下觀察肺組織結構破壞嚴重，肺間質彌漫性充血水腫，肺泡腔內有大量的中性粒細胞浸潤。見圖1B。

A正常對照組；B 模型對照組；C地塞米松組；D 中藥治療組；E 中藥防治組

地塞米松組和中藥組雙側肺葉輕度充血，局部肺葉表面可見散在的出血點，肺葉彈性良好，胸腔內有少量稀薄的滲出液；光鏡下肺結構損傷較模型對照組明顯減輕，且中藥防治組改善情況最為明顯，肺間質輕度充血水腫，內有少量中性細胞浸潤。見圖1C、D、E。

2.3各組大鼠肺濕重/干重(W/D)比值

與正常對照組比較，其余組大鼠肺組織W/D比值明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，地塞米松組和中藥組均有下降(P<0.01)；中藥防治組較中藥治療組低(P<0.05)，而與地塞米松組間無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.4各組大鼠BALF中蛋白濃度

與正常對照組比較，其余組大鼠BALF中蛋白濃度均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型對照組比較，藥物干預組BALF中蛋白濃度均降低(P<0.01)；中藥治療組BALF中蛋白濃度高于中藥防治組(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠肺W/D比值及BALF中

注： 與正常對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型對照組比較，cP<0.05，dP<0.01；與地塞米松組比較，eP<0.05 ，fP<0.01；與中藥治療組比較，gP<0.05，hP<0.01。

2.5各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度

與正常對照組比較，其余組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型對照組比較，藥物干預組中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低(P<0.01)；地塞米松組與中藥防治組TNF-α、IL-1β濃度無明顯差異(P>0.05)，而中藥治療組TNF-α、IL-1β、IL-6低于中藥防治組(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2　各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的

注： 與正常對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型對照組比較，cP<0.05，dP<0.01；與地塞米松組比較，eP<0.05 ，fP<0.01； 與中藥Ⅰ組比較，gP<0.05，hP<0.01。

3討論

LPS誘導內毒素型ALI大鼠模型的制備運用較廣，有腹腔注射、尾靜脈注射、氣管滴入等方法[5]，其中氣管滴入法可直接造成肺的損傷。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，損傷肺泡—毛細血管膜，使其通透性增加，血管內漏致使肺水腫；Ⅱ型肺泡細胞損傷，表面活性物質合成減少，肺張力減小致肺不張。從而出現肺容積減少、通氣/血流比例失調、氧合指數和肺順應性降低，從而出現低氧血癥和呼吸窘迫，即ALI。本研究采用LPS(5 mg/kg)氣管滴入法制備ALI大鼠模型，通過觀察到大鼠呼吸、精神等一般情況的改變，肺組織大體和鏡下病理改變，屬于ALI的典型表現；檢測肺 W/D 比值、BALF中蛋白濃度和肺組織中炎癥因子含量，反應了ALI的嚴重程度及藥物干預后的改善情況。

ALI屬于中醫“喘證”范疇，該病表現為“氣虧耗不足以息而喘”，病理基礎為肺不主氣、肺失宣降，病機關鍵是虛、濕、瘀、熱[6]。肺為嬌臟，易感外邪，在六淫、疫毒等外邪作用下導致肺氣受損、宣降失司；肺為水之上源、通調水道，氣虛較重不能行水故水濕內停；肺朝白脈，氣為血之帥，氣虛血行不利故肺脈瘀阻。根據主要病機筆者采用益氣活血中藥黃芪、丹參防治ALI，且課題組既往臨床研究[7]表明益氣活血中藥能改變肺循環高凝狀態，降低血液黏度，減輕患者氣管黏膜充血、水腫，使炎性反應顯著改善，并通過抑制中性粒細胞在肺組織中的滲出顯著減輕肺的直接和繼發損傷。

ALI/ARDS是炎癥反應失控的結果，TNF-α、IL-6、IL-1β等細胞因子參與了炎癥反應、組織損傷的過程[8-9]，TNF-α 是ALI最重要的啟動因子，能夠刺激氧自由基、蛋白溶解酶的大量釋放，趨化中性粒細胞在肺內聚集、粘附，導致肺泡-毛細血管損傷，其可反應肺組織損傷的嚴重程度[10-12]；IL-1β主要由單核-巨噬細胞產生，是急性反應的主要調節物質，能誘導IL-6、IL-8等產生，且IL-6是強有力的促炎因子，能夠放大肺部的炎癥反應[12-15]。故本研究亦從炎癥角度觀察益氣活血中藥對ALI的防治作用，其結果顯示：LPS造模后肺組織中炎癥因子含量均明顯升高，而地塞米松組和中藥治療、防治組較模型對照組顯著降低，提示一定的藥物干預可以有效地降低TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，減輕肺部的炎癥反應；中藥防治組TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于中藥治療組，說明益氣活血中藥防治結合較單純治療具有更好的療效；光鏡下模型對照組肺組織出現明顯充血、水腫、炎性細胞浸潤及肺間隔增寬等典型的ALI病理改變，而藥物干預能夠改善其病變程度；肺W/D比值可反應肺水腫的嚴重程度，BALF中蛋白濃度可反映肺臟血氣屏障的通透性，藥物組均較模型對照組降低，說明益氣活血中藥能減少蛋白漏出，改善肺水腫的狀況，且防治結合效果更好。

綜上所述，本研究結果表明益氣活血中藥對LPS致ALI大鼠具有防治作用，其可改善肺組織的病變程度，減輕炎癥反應，且早期藥物干預有助于ALI的預后。其機制可能與其降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平有關，這可為益氣活血法在臨床上防治內毒素型ALI提供一定思路，但關于益氣活血中藥對ALI防治作用分子機制尚不明確，有待進一步研究。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Preventive effect ofYiqiHuoxuerecipe on lipopolysaccharide induced acute lung injury in rats

QINLi,WAGNYu-guo,LIMin,etal.

DepartmentofTraditionalChineseMedicine,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the preventive effect of Yiqi Huoxue recipe on acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide (LPS), and explore its mechanism.MethodsForty healthy male SD rats were randomly divided into normal control group, model control group, dexamethasone group, herbs treatment group, herbs prevention group, eight rats in each group. ALI models were established by intratracheal instillation of LPS (5 mg/kg) while normal control group was instilled normal saline. 3 days before and after making the model，the drug(0.59g/mL herbs or dexamethasone for 5mg/kg)or same amount of normal saline was given by gavage in each group，and observe their respiration, activity and so on. Rats were sacrificed after 2h of the last administration. Then the lung wet weight / dry weight (W/D) ratio and the protein content in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was measured, and the pathological changes in lung tissues．ResultsCompared with normal control group, LPS groups exhibited a higher level of the lung W/D weight ratio, the protein content in BALF and the content of TNF-α, IL-1β, IL-6 in lung tissue (P<0.01); compared with model control group, the indexes in dexamethasone group and herbs group were decreased (P<0.01); compared with herbs treatment group, the indexes in herbs prevention group were decreased (P<0.01 or P<0.05); the lung W/D weight ratio, the content of TNF-α, IL-1β between dexamethasone group and herbs prevention group were close (P>0.05). ConclusionYiqi Huoxue recipe can reduce the contents of inflammatory cytokines and protein content in BALF of LPS induced ALI rats, reduce the pathological damage of lung tissue and pulmonary edema, have the effect of prevention and treatment of acute lung injury.

【Key words】Yiqi Huoxue recipe；Acute lung injury；Lipopolysaccharide

(收稿日期：2015-12-04)

Corresponding author:DOU Yong-qi, E-mail: dyqi_301@yeah.net

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.05.007

作者簡介：秦麗(1990- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中西醫結合臨床。E-mail：qinlizi301@163.com通訊作者： 竇永起(1965- )，碩士，主任醫師，教授，博士生導師。研究方向：中西醫結合臨床。E-mail：dyqi_301@yeah.net

基金項目：國家自然科學基金(81303131)