3DHepG2細胞藥物肝毒性評價模型的建立及其在藥物安全性評價中的應用

李丹丹　湯響林　譚洪玲　梁乾德　王宇光　馬增春　肖成榮　高月

[摘要]該研究采用磁懸浮3維（3D）培養技術建立了3D HepG2細胞評價模型，并應用此模型對典型的肝毒性藥物進行了簡單評價。HepG2細胞形成穩定3D結構后，采用免疫組化技術檢測了HepG2細胞在2D，3D培養條件下的糖原儲存能力，并應用RTPCR技術對比研究了HepG2細胞在2D，3D不同培養條件下Ⅰ相、Ⅱ相藥物代謝酶、藥物轉運體、核受體及肝細胞特異標志性分子白蛋白（ALB）等相關基因的mRNA 表達水平。免疫組化結果顯示，HepG2細胞在3D培養條件下具有豐富的糖原儲存能力，此特性與人肝組織相類似。此外，在3D培養條件下，HepG2細胞絕大部分藥物代謝酶、轉運體、核受體及ALB的mRNA表達水平與2D相比均有不同程度的上調。在藥物肝毒性評價方面，該實驗選用了典型的肝毒性藥物對乙酰氨基酚（APAP）和近年來肝毒性報道較多的中藥何首烏Polygonum multiflorum Thunb及補骨脂Psoraleae corylifolia L進行單劑量和重復劑量（7 d）給藥實驗；在重復劑量給藥實驗中，3D HepG2細胞表現出更高的敏感性。應用磁懸浮3D培養技術建立的3D HepG2細胞模型無論在形態上還是功能上都更接近于人的肝組織，是較好的3D肝毒性評價模型。

[關鍵詞]3D培養；肝毒性；評價模型

[Abstract]3D in vitro toxicity testing model was developed by magnetic levitation method for culture of the human hepatoma cell line HepG2 and applied to evaluate the drug hepatotoxicity After formation of stable 3D structure for HepG2 cells， their glycogen storage capacity under 2D and 3D culture conditions were detected by immunohistochemistry technology， and the mRNA expression levels of phase Ⅰ and Ⅱ drug metabolism enzymes， drug transporters， nuclear receptors and liverspecific marker albumin（ALB） were compared between 2D and 3D culture conditions by using RTPCR method Immunohistochemistry results showed that HepG2 cells had abundant glycogen storage capacity under 3D culture conditions， which was similar to human liver tissues The mRNA expression levels of major drug metabolism enzymes， drug transporters， nuclear receptors and ALB in HepG2 cells under 3D culture conditions were upregulated as compared with 2D culture conditions For drug hepatotoxicity evaluation， the typical hepatotoxic drug acetaminophen（APAP）， and most reported drugs Polygonum multiflorum Thunb（Chinese name Heshouwu） and Psoraleae corylifolia L（Chinese name Buguzhi） were selected for single dose and repeated dose（7 d） exposure In the repeated dose exposure test， 3D HepG2 cells showed higher sensitivity This established 3D HepG2 cells model with magnetic levitation 3D culture techniques was more close to the human liver tissues both in morphology and functions， so it was a better 3D hepatotoxicity evaluation model

[Key words]3D culture； hepatotoxicity； evaluation model

doi：10.4268/cjcmm20160725

近年來，中藥在用于治療各種疾病并取得確切療效的同時，其所致毒性和不良反應事件亦頻繁發生，而肝臟作為藥物代謝的主要器官無疑是受藥物損傷最嚴重的靶器官[1]。因此，中藥的毒性研究，尤其是肝毒性研究受到廣泛關注，尋找能夠準確、快速、靈敏反映藥物肝毒性的技術與模型已成為當前中藥安全性評價亟待解決的重大問題。

傳統2D培養的HepG2細胞無極化形態，低表達藥物代謝酶和轉運體，這也常被認為是限制其毒性預測能力的關鍵因素之一[2]。本研究采用由美國Nano3D Biosciences公司研發的磁懸浮3D培養技術，通過優化3D HepG2細胞單個球體的細胞數量、培養基體積及培養時間所建立的3D細胞模型，在保持肝細胞形態和功能上具有明顯的優勢，可應用于藥物安全性評價和高通量篩選。

1材料與方法

11藥物、試劑與儀器對乙酰氨基酚（日本TCI公司，CAS：103902）；生首烏（北京同仁堂，批號20120707）；補骨脂（北京同仁堂，批號20131008）；DMEM，PBS，胰酶（美國GIBCO公司）；胎牛血清（天津康源生物技術有限公司）；Trizol（美國Sigma公司）；引物合成（北京博邁德科技發展有限公司）；cDNA反轉錄試劑盒，RTPCR試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；CellTiterGlo熒光細胞活性檢測試劑盒（美國Promega公司）；多聚甲醛（廣東西隴化工股份有限公司）；糖原 PAS染色液試劑盒（上海瑞谷生物科技有限公司）；NanoShuttleTMPL磁納米粒、96孔磁鐵驅動（美國Nano3D公司）； T25細胞培養瓶、96孔普通培養板、96孔超低吸附培養板（美國Corning公司）；CO2培養箱（美國Thermo公司）；超微量分光光度計（美國GE公司）；StepOnePlus RTPCR System（美國Applied Biosystem公司）。

12藥物制備精密稱取生首烏（PM）適量，加10倍蒸餾水浸泡30 min后，煎煮2次，每次2 h；合并2次濾液并過濾，經旋轉蒸發儀濃縮后，冷凍干燥成粉末。用培養基稀釋所得粉末配成質量濃度為60 g·L-1的母液，過濾除菌，稀釋至各給藥濃度。

精密稱取補骨脂（PC）適量，加10倍蒸餾水浸泡30 min后，煎煮2次，每次30 min；合并2次濾液，過濾、濃縮后，冷凍干燥成粉末。用培養基稀釋所得粉末配成質量濃度為60 g·L-1的母液，過濾除菌，稀釋至各給藥濃度。

精密稱取對乙酰氨基酚（APAP）適量，加入培養基配成濃度為30 μmol·L-1的母液，過濾除菌，用培養基稀釋至各給藥濃度。

133D HepG2細胞培養人肝癌HepG2細胞購自北京協和細胞庫，生長于含10%胎牛血清的DMEM中，于37 ℃恒溫、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。待細胞生長至80%匯合時加入NanoShuttleTMPL磁納米粒37 ℃孵育過夜，使細胞磁化。次日將HepG2細胞接種于超低吸附的96孔板中，每孔約1×104個細胞，在96孔板頂部放置磁鐵驅動，使細胞被吸引和聚集。HepG2細胞可在15 min內聚集成細胞團形成3D結構，此時可移去磁鐵驅動。磁懸浮3D培養技術的具體操作流程見圖1[3]。

14細胞免疫組化3D HepG2細胞培養24 h后，吸棄培養液并用PBS輕輕漂洗2次，用4%多聚甲醛室溫固定20 min后進行糖原 PAS染色，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

15RNA提取和RTPCR分析Trizol法抽提總RNA，逆轉錄成cDNA，反應條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。RTPCR所用引物序列見表1，反應程序：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。以GAPDH為內參，采用Livak（2-ΔΔCt）法進行相對基因表達分析。

16藥物細胞毒性實驗2D與3D HepG2細胞分別接種于普通與超低吸附的96孔板中，培養24 h后進行細胞毒性測試。給藥24 h后，采用CellTiterGlo熒光細胞活性檢測試劑盒檢測細胞活性。此外，還對3D HepG2細胞進行了重復給藥毒性實驗，每隔24 h給藥1次，重復給藥1周。

17統計學方法實驗數據以±s表示，使用SPSS 180軟件進行統計處理，采用單因素方差分析，P<005為差異具有統計學意義。

2結果

213D HepG2細胞結構與功能接種于超低吸附96孔板中的HepG2細胞，在放置磁鐵驅動15 min后即可形成緊密連接的3D球體結構，球體直徑為1～2 mm，可持續培養1周以上。2D，3D HepG2細胞形態見圖2。

222D與3D HepG2 細胞基因表達比較RTPCR結果顯示，HepG2細胞在3D培養條件下絕大多數藥物代謝酶、藥物轉運體及核受體的基因表達水平與2D相比均有不同程度的上調，見圖4。其中I相藥物代謝酶CYP3A4基因表達水平上升最為明顯，約為2D培養時的59倍。藥物轉運體BSEP和MRP2是肝細胞毛細膽囊膜上主要的轉運蛋白，在內外源物質轉運方面發揮重要作用，它們在3D培養時基因表達量分別上升34，28倍。核受體中PXR上升最為顯著，約為2D培養時的25倍。此外，肝細胞特異標志性分子白蛋白（ALB）在3D培養時基因表達量上升了35倍。

232D，3D HepG2細胞毒性研究通過比較2D，3D HepG2細胞單劑量和重復劑量給藥細胞毒性試驗，發現3D培養條件下的細胞對藥物的反應更為敏感，見圖5。當給以細胞單劑量、低濃度的APAP（009～188 μmol·L-1），PM（018～375 g·L-1）或PC（018～375 g·L-1）時，3D HepG2細胞球體的疏松程度、細胞形態及細胞活力均發生明顯改變，而2D HepG2細胞并無此類明顯變化；當給予3D HepG2細胞重復劑量（7 d）APAP或PM時，細胞對藥物的敏感性明顯增強：APAP重復劑量給藥時的IC50 076 μmol·L-1顯著小于單劑量給藥時的541 μmol·L-1，PM重復劑量給藥時的IC50 286 g·L-1顯著小于單劑量給藥時的1160 g·L-1， PC重復劑量給藥時的IC50 369 g·L-1顯著小于單劑量給藥時的1471 g·L-1。

3討論

肝臟是藥物代謝的主體，肝實質細胞或肝細胞都含有多數藥物代謝所需的酶和轉運體，這些酶和轉運體在藥物代謝和毒性方面發揮著重要作用[2]。傳統2D培養的細胞呈平面生長，缺少細胞與細胞、細胞與胞外基質間的接觸，細胞極化現象消失，低表達藥物代謝酶和轉運體，這些都大大限制了其在藥物安全性評價中的應用[2，4]。多種3D模型表明，細胞在3D培養條件下能較好的維持其極化狀態和保持肝組織特有的功能[58]。由美國Nano3D Biosciences公司研發的磁懸浮3D培養技術是近年來新興的一種3D培養技術，其主要原理是向2D 培養的細胞培養體系中加入由金納米顆粒、氧化鐵和細胞粘附多肽組成的磁性納米顆粒使細胞磁化，通過外加磁場使細胞聚集成團后移除磁場，細胞便可在3D空間生長并分泌細胞外基質[9]。

本研究采用磁懸浮3D培養技術培養的人肝癌HepG2細胞與常規2D培養相比，不僅高表達絕大多數Ⅰ相、Ⅱ相藥物代謝酶、藥物轉運體、核受體及肝細胞特異的標志性分子ALB，還具有豐富的糖原儲存功能，與多數文獻報道的3D肝細胞模型的特性相類似[58]。此外，因其能持續培養7 d以上，還可進行重復給藥實驗。在重復給藥實驗中，3D HepG2細胞對藥物的敏感性顯著提高。

中藥具有多成分、多靶點、多途徑的復雜作用特征，且臨床病人服藥周期從幾周到幾個月不等。常規2D培養的細胞僅能進行單次給藥毒性實驗，難以評估藥物長期作用時的毒性大小；而采用磁懸浮3D培養技術培養的HepG2細胞可持續培養一周以上，進行多劑量重復給藥實驗，用于模擬藥物長期低劑量使用時對人體肝細胞損傷的影響，與2D 細胞模型相比更符合中藥臨床的實際用藥情況。

目前大多數3D細胞培養方法都要用到基質膠、聚合物支架等生物材料，這些方法往往費用昂貴，且3D細胞從培養到成型耗時近一個月，不利于大規模藥物的快速篩選與毒性評價。磁懸浮3D培養技術與常規3D培養技術相比，3D細胞成型快（僅需1 d），操作簡便，費用低廉，且細胞幾小時之內就能形成緊密連接并自行分泌細胞外基質，是理想的藥物毒性評價及高通量篩選模型。

[參考文獻]

[1]黃幼異，孫蓉. 系統生物學技術用于中藥肝毒性發現與評價的研究進展[J]. 中國藥物警戒， 2013（10）：219.

[2]Ramaiahgari S C， den Braver M W， Herpers B， et al. A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liverlike properties for repeated dose highthroughput toxicity studies[J]. Arch Toxicol，2014，88（5）：1083.

[3]Tseng H， Balaoing L R， Grigoryan B， et al. A threedimensional coculture model of the aortic valve using magnetic levitation[J]. Acta Biomater， 2014（10）：173.

[4]李曼， 董延生， 李澤君， 等. 體外肝毒性評價細胞模型的研究進展[J]. 中國新藥雜志， 2015（24）：1954.

[5]Gunness P， Mueller D， Shevchenko V， et al. 3D organotypic cultures of human HepaRG cells：a tool for in vitro toxicity studies [J]. Toxicol Sci， 2013， 133（1）：67.

[6]Takayama K， Kawabata K， Nagamoto Y， et al. 3D spheroid culture of hESC/hiPSCderived hepatocytelike cells for drug toxicity testing[J]. Biomaterials， 2013， 34（7）：1781.

[7]Kostadinova R， Boess F， Applegate D， et al. A longterm three dimensional liver coculture system for improved prediction of clinically relevant druginduced hepatotoxicity [J]. Toxicol Appl Pharmacol， 2013， 268（1）：1.

[8]Khetani S R，Bhatia S N. Microscale culture of human liver cells for drug development[J]. Nat Biotechnol， 2008， 26（1）：120.

[9]Haisler W L， Timm D M， Gage J A， et al. Threedimensional cell culturing by magnetic levitation[J]. Nat Protoc， 2013， 8（10）：1940.

[責任編輯曹陽陽]