海島棉單萜合酶基因克隆及其受黃萎病誘導的基因表達分析

楊璨　孫全　王微娜　耿帥鵬

摘要：【目的】克隆海島棉品種新海15中單萜合成酶基因（GbTPS），研究其受黃萎病誘導的表達情況，為進一步研究該基因在棉花抗黃萎病中的功能打下基礎。【方法】克隆GbTPS基因的開放閱讀框（ORF）全長序列，對其蛋白序列進行生物信息學分析，并采用實時熒光定量PCR及病毒誘導的基因沉默對其抗病性進行分析。【結果】通過PCR擴增得到一個全長為1761 bp的ORF序列，命名為GbTPS（GenBank登錄號：KP247548）。生物信息學分析發現，該基因編碼586個氨基酸，預測分子量為67.7 kD，等電點為5.79。系統進化樹分析結果表明，GbTPS屬于Tps-g亞家族。GbTPS基因經黃萎病菌誘導后，表達量在4～24 h內顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于空白對照組。病毒誘導的基因沉默受黃萎病誘導后其病情指數為52.38，與對照組相比并無明顯差異。【結論】GbTPS基因僅在棉花抗黃萎病的早期發揮積極作用。

關鍵詞： 棉花；單萜合酶；GbTPS基因；黃萎病；實時熒光定量PCR

中圖分類號： S562；Q344 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）05-0604-07

Abstract：【Objective】A monoterpene synthetase gene GbTPS was cloned from Gossypiumbar badense， and its expression induced by Verticillium wilt were analysed， in order to lay a foundation for studying resistance of cotton to Verticillium wilt. 【Method】The full-length open reading frame（ORF） of GbTPS gene was cloned， and its encoded protein was analysed by bioinformatics， the real-time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR） and virus induced gene silencing was used to analyse resistance to Verticillium wilt. 【Result】Full-length ORF was obtained， with length of 1761 bp， and named GbTPS（Genebank accession number： KP247548）. The bioinformatics analysis showed that， the protein composed of 586 amino acids was coded by GbTPS gene， its predicted molecular weight was 67.7 kD， its isoelectric point was 5.79. Phylogenetic tree analysis showed that， GbTPS belonged to Tps-g subfamily. The expression of GbTPS gene was significant（P<0.05） or extermely significant（P<0.01） higher than that of blank control within 4-24 h after being induced by Verticillium dahlia. The disease index of virus induced gene silencing was 52.38， and had no significant difference with that of control. 【Conclusion】Only at the early stage， the GbTPS gene plays a positive role in resistance to cotton Verticillium wilt.

Key words： cotton； monoterpene synthase； GbTPS gene； Verticillium wilt； qRT-PCR

0 引言

【研究意義】棉花是一種重要的經濟作物，在我國乃至世界的經濟發展中有著重要地位，是棉制品和服裝的重要材料來源，但生產中易受黃萎病菌的侵害而導致大量減產。萜類化合物是植物中種類最多的一類天然烴類化合物，又名類異戊二烯。目前，已分離到的萜類達4萬多種（胡永健等，2007）。植物中的萜類化合物包括初生代謝物和次生代謝物，其中次生代謝萜類化合物具有抗病蟲害的重要作用。隨著分子生物學的發展，萜類合成的關鍵酶及其在防御作用中的分子機理逐漸成為植物防御研究中的熱點之一。萜類合成酶（Terpene Synthases，TPS）是萜類合成過程中的關鍵酶，也是棉花抗黃萎病過程中的一種重要酶，如δ杜松烯合成酶是合成棉花抗毒素的關鍵酶（Tan et al.，2000）。抗病基因在抗病過程中起著識別病原菌和開啟抗病信號途徑的重要作用，而萜類合成酶受萜類合成酶基因的調控。因此，研究萜類合成酶的相關基因是研究萜類化合物抗病性的關鍵。【前人研究進展】Mace等（1985）在研究萜類物質的過程中發現，脫氧半棉酚對黃萎病菌的抗性優于脫氧半棉酚甲醚、半棉酚和半棉酚甲醚。Mace等（1989）對感染黃萎病的海島棉進行基因表達分析，結果發現與萜烯生物合成途徑相關的基因均受黃萎病誘導表達。Kawchuk等（2001）從番茄中克隆到Ve1、Ve2兩個抗黃萎病基因。Zuo等（2005，2007）在接種黃萎病V991的海島棉7124中克隆獲得2個與乙烯信號傳導途徑相關的基因（GbERF1和GbERF2），后續研究證明它們可能在海島棉抗黃萎病的過程中發揮一定作用。【本研究切入點】目前，前人已進行了棉花黃萎病菌致病力分化（林玲等，2005；喬艷艷等，2015）、黃萎病QTL定位（劉劍光等，2014）等研究，而關于抗黃萎病基因的研究非常少。本課題組前期通過接種黃萎病菌的方法，對棉花不同時期及抗性品種進行了轉錄組測序，篩選到1個在接種后具有顯著差異表達的TPS基因片段，但該基因在棉花抗黃萎病中是否起關鍵作用仍需深入研究。【擬解決的關鍵問題】通過克隆GbTPS基因，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對GbTPS基因在浸染黃萎病后進行表達水平分析，研究GbTPS基因在抗病性中的作用，為闡釋其分子功能提供參考，并對GbTPS進行病毒誘導的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS），以期為進一步研究該基因的功能打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試高抗黃萎病海島棉（Gossypium barbadense）品種新海15由中國農業科學院安陽棉花研究所提供；黃萎病菌菌種（Verticillium dahlia）由河南省植物逆境生物學重點實驗室提供。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 總RNA抽提 播種前剪掉種殼頂端，將種子于清水中浸泡5～6 h后，放置于鋪有濕潤棉花的培養皿中，覆蓋一層濕潤的棉花，放置于培養箱中等待萌發。次日將已出芽的棉花種子播種于邊長為7 cm的花盆（土∶蛭石∶營養土=2∶1∶1）中，置于光照培養箱中培養（25 ℃，L∶D=16 h∶8 h）。

待幼苗長至2片真葉時，通過傷根處理，接種濃度為1×107 N/L的黃萎病菌，并于接種后24 h取葉片，通過無菌水清洗后，參考EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊公司）進行RNA抽提，并將檢測合格的樣品置于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1. 2. 2 GbTPS基因克隆 利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒對總RNA進行反轉錄，獲得單鏈cDNA，體系為：RNA 3.0 μL，Oligo（dT）2.0 μL，DEPC水8.0 μL，70 ℃ 10 min；RNase 0.5 μL，M-MLV反轉錄酶1.0 μL，5×Buffer 5.0 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，DEPC水3.5 μL，42 ℃ 90 min，72 ℃ 10 min。設計引物GbTPS-F和GbTPS-R對該基因進行擴增（表1），引物設計原則為上、下游引物分別位于該基因開放閱讀框的兩端，且盡量保證兩條引物的長度、退火溫度相差不明顯，盡量避免引物二聚體結構的出現，引物由華大基因合成。

GbTPS基因的PCR反應體系50.0 μL，包括5×Trans Start Fast Pfu Fly Buffer 10.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 5.0 μL、上游引物（GbTPS-F）和下游引物（GbTPS-R）各1.0 μL、DNA聚合酶（Trans Start Fast Pfu Fly DNA polymerase）1.0 μL、cDNA模板1.0 μL，用ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物膠回收后連接至pMD18-T載體并送華大基因測序。

1. 2. 3 基因生物信息學分析 編碼氨基酸序列的預測、葉綠體轉運肽、等電點和分子質量等分別通過Translate tool（http：//web.expasy.org/translate/）、ChloroP

1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）、Gneneva大學的ExPASy服務器（http：//μs.expasy.org/

tools/protparam.html）進行分析。使用ClustalX 2.0進行多重序列比對，運用MEGA 3.1基于Neighbour-joining方法構建系統發育進化樹。

1. 2. 4 qRT-PCR分析 待棉花苗長到2葉1心時，參考蘸根法進行黃萎病的浸染，分別將浸染過和未浸染過的棉花苗在以下時間點取樣：0、1、4、8、12、24、36、48和72 h。參考1.2.1和1.2.2的方法提取RNA并反轉錄獲得cDNA。

使用引物qGbTPS-F和qGbTPS-R進行PCR檢測，以UBQ7為內參，引物序列見表1。反應體系10.0 μL：含SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）5.0 μL，上、下游引物各0.3 μL，ROX Ⅱ 0.2 μL，cDNA模板3.0 μL，ddH2O 1.2 μL。試驗設3次重復，使用ABI 7300熒光定量PCR儀的默認程序進行檢測，結果使用公式2-△△Ct進行計算。

1. 2. 5 VIGS載體pTRV-GbTPS構建 使用引物GbTPS-

F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）擴增GbTPS基因的部分片段用于構建VIGS載體。

PCR反應體系：Ex Taq Version 2.0 Plus dye（Premix Taq）10.0 μL，引物GbTPS-F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，加8.0 μL ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環；72 ℃延伸10 min。

上述擴增獲得的PCR產物和pTRV（由棉花生物學國家重點實驗室保存）分別使用BamHⅠ和KpnⅠ進行雙酶切，回收目的片段進行連接并轉化大腸桿菌，測序驗證獲得陽性載體命名為pTRV-GbTPS，將其轉化農桿菌（GV3101）備用。轉化農桿菌方法：取100 μL農桿菌感受態于冰上靜置，待其溶化，加入1 μL pTRV-GbTPS質粒輕輕混合均勻，冰浴30 min后于液氮中速凍70 s，再迅速放入37 ℃水浴中保持5～6 min，于超凈工作臺中加入1 mL新鮮空白LB液體培養基，28 ℃下180 r/min搖床培養4 h，4000 r/min離心5 min，吸去500 μL LB液體培養基，懸浮菌體，涂布于含有相應抗生素（卡那+慶大霉素/利福平）的培養基上，28 ℃倒置培養2～3 d。

1. 2. 6 GbTPS基因沉默 取pTRV-GbTPS和pTRV1、pTRV2（空載體）、Cla農桿菌于含慶大霉素、卡那霉素、MES（10 mmol/L）和AS（15 μmol/L）的液體LB培養基培養至OD600為0.6～0.8時，收集菌體并浮于等體積浸染液，浸染液成分及其終濃度為：MES（10 mmol/L）、AS（150 μmol/L）、MgCl2（10 mmol/L）。將pTRV1與pTRV-GbTPS、pTRV2（空載體）及Cla農桿菌懸浮液以1∶1的比例混合。

待培養的幼苗長到1葉（真葉）1心階段，選擇長勢良好的棉花苗進行注射，于25 ℃培養箱中遮光處理24 h后正常培養。

1. 2. 7 黃萎病菌浸染 VIGS處理的棉花幼苗生長到2葉1心時，參考蘸根法將幼苗從培養盆里取出（Cla農桿菌處理的幼苗除外），傷根后浸入黃萎病菌液中40 s并重新移栽到培養盆中，澆水并放回光照培養箱中培養。參考早（苗）期鑒定黃萎病發病程度的分級標準，適時觀察發病情況，統計病情指數。

1. 2. 8 GbTPS基因半定量RT-PCR分析 如上VIGS處理的棉花幼苗生長到2葉1心時，處理組（pTRV- GbTPS）和對照組（pTRV2）分別取3～4片第2真葉提取RNA，逆轉錄成cDNA后進行半定量PCR。使用引物GbTPS-F（VIGS）和GbTPS-R（VIGS），其反應體系為：Ex Taq Version 2.0 Plus dye（Premix Taq）10.0 μL，引物GbTPS-F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，加ddH2O補足至20.0 μL。反應程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環；72 ℃延伸10 min。

2 結果與分析

2. 1 GbTPS基因克隆

通過PCR擴增得到約1700 bp的條帶（圖1），測序后該基因全長為1761 bp，與預期的棉花萜類合成酶基因一致，命名為GbTPS（GenBank登錄號：KP247548）。

2. 2 GbTPS蛋白質序列的生物信息學分析

2. 2. 1 預測氨基酸序列的理化性質分析 通過生物信息學分析發現，GbTPS基因編碼586個氨基酸序列；其分子質量為67.7 kD，等電點為5.79，氨基酸N'端轉運肽分析結果如表2所示：GbTPS含有葉綠體轉運肽，主要定位于葉綠體。

2. 2. 2 GbTPS蛋白的多序列列隊分析 多序列比對結果（圖2）顯示，GbTPS蛋白與其他蛋白序列一樣，也具有“DDxxD”、（N，D）D（L，I，V）x（S，T）xxxE和LQLYEASFLL保守序列，但缺少“RRx8R”基序，具有TPS家族典型的保守序列特征。其氨基酸N'端均有一段葉綠體轉運肽，這些特征均是植物單萜合酶的典型特征。因此，推測GbTPS可能是海島棉中的單萜合酶。

2. 2. 3 GbTPS蛋白的進化分析 GbTPS蛋白的系統進化樹分析結果（圖3）表明，萜類合酶共有7個亞家族分支，分別為Tps-a、Tps-b、Tps-c、Tps-d、Tps-e、Tps-f和Tps-g，克隆得到萜類合酶GbTPS與擬南芥芳樟醇合成酶聚類到一個分支上，同屬于萜類合酶Tps-g亞家族，進一步證明該基因是海島棉中一個單萜合酶基因，合成的單萜為非環狀單萜，易揮發。

2. 3 GbTPS基因的qRT-PCR表達模式分析

qRT-PCR檢測GbTPS在被黃萎病浸染后不同時間點的轉錄水平的表達量，為消除黃萎病浸染時傷根處理對棉花根部造成的影響，以進行同樣傷根處理但并未浸染黃萎病的健康苗作為對照。

空白對照組與試驗組均以UBQ7基因作為內標，且分別以各自0 h時期的表達量作為參照因子，圖4為各時間點對照組與試驗組中GbTPS基因的表達量，結果顯示：GbTPS基因的表達量在接種后呈升高—降低—升高—降低的波動趨勢，在4～24 h內其表達水平顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于對照組，之后其表達量便低于對照組，且在72 h時與對照組表達水平幾乎一致。

2. 4 GbTPS基因的VIGS誘導結果

對試驗組（pTRV-GbTPS）和對照組（pTRV2）所取的真葉樣品分別提取RNA反轉錄得到cDNA后進行PCR檢測，結果如圖5所示。由圖5可看出，對照組能檢測到目的基因，而試驗組中目的基因的表達量幾乎檢測不到，表明GbTPS基因已被沉默。

在VIGS處理幼苗經黃萎病菌侵染后，統計其黃萎病的發病情況，結果如圖6所示。被干涉掉Cla基因的棉花苗出現白化癥狀（圖6-A），進一步證明其干涉效果良好。從圖6-B可看出，試驗組和對照組均出現發病癥狀，由試驗組和對照組整體發病情況的對比（圖6-C）可以看出，其結果并無明顯差異。根據病情指數統計結果（表3）顯示，試驗組的病情指數與空白對照組無明顯差別，說明該基因的沉默并未對棉花的發病情況造成影響。

3 討論

單萜化合物在棉花抗黃萎病過程中發揮重要作用。單萜為C10類萜類化合物，含有保守性結構域“DDXD”，該結構域位于活性位點的入口處，具有結合二價金屬陽離子（如Mg2+）的功能（Sacchettni and Poulter，1997）；此外，植物的單萜合酶還具有“RRx8R”保守域和葉綠體轉運肽（Aubourg et al.，2002）。萜類合酶均起源于古萜類合酶，根據其同一亞家族的不同氨基酸序列間至少有40%一致性的標準，將其分為7個亞家族（Tps-a～Tps-g）（Bohlmann et al.，1998），其中Tps-b、Tps-d、Tps-f和Tps-g 4個亞家族包含單萜合酶，Tps-a亞家族包含倍半萜合酶和二萜合酶（Chen et al.，2011）。通過生物信息學分析，本研究克隆得到的GbTPS基因編碼氨基酸序列具有“DDxxD”和葉綠體轉運肽等單萜所特有的保守結構域，同時也含有LQLYEASFLL、DDxxD和xxSxxxE等萜類共有的保守結構域，表明該基因為典型的單萜合酶基因。通過ClustalX 2.0進行序列對比，MEGA 3.1進行系統發育進化樹分析，其結果表明該基因與擬南芥芳樟醇合成酶同屬于Tps-g亞家族。

本研究的qRT-PCR結果表明，GbTPS基因的表達量呈升高—降低—升高—降低的波動趨勢，與前人報道萜類釋放具有節律性的結果一致（Rohdichet al.，2005；Withers and Keasling，2007），且該節律性受對應的萜類合成酶的調控。棉花在浸染黃萎病后1 h內表達量低于對照組，在4～24 h內表達量顯著或極顯著高于對照組，之后又低于對照組，且在72 h時其表達量幾乎與對照組無差別，表明4～24 h內該基因受黃萎病誘導顯著上調，且在感染黃萎病的1 h內及24 h后其表達受到抑制，故推測該基因在棉花感染黃萎病菌后的4～24 h內可能具有抗病作用。VIGS處理結果表明，缺失GbTPS基因的棉花在浸染黃萎病后其發病情況與對照組相比并無明顯差異，結合qRT-PCR結果，表明GbTPS基因可能只在棉花感染黃萎病菌的初期具有抗病作用。本研究對GbTPS基因的抗黃萎病性進行了初步探索，后續研究將定位于棉花感染黃萎病的初期階段。

4 結論

本研究結果表明，海島棉單萜合成酶基因GbTPS僅在棉花抗黃萎病的早期發揮積極作用。

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（責任編輯 王 暉）