純種發酵淡豆豉異黃酮提取物對人乳腺癌細胞MCF—7的生長影響

劉力豪 蔡琨 王曉敏

【摘要】目的：研究純種發酵淡豆豉異黃酮提取物在體外對人乳腺癌細胞MCF-7的生長影響。方法：用不同劑量組對體外培養的MCF-7細胞分別干預12、24、36、48、72h后，用MTT法觀察其對MCF-7細胞的生長影響。結果：①純種發酵淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細胞12、24、36h，其濃度5、10、20、40mg/L（除24h 10mg/L外）均表現出對MCF-7細胞穩定的抑制作用，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）；②純種發酵淡豆豉異黃酮對人乳腺癌MCF-7細胞抑制作用，在一定濃度、作用時間有依賴關系，與大豆異黃酮抑制作用相比差異無統計學意義（P>0.05）。結論：純種發酵淡豆豉有明確的抗乳腺癌的作用，其24h IC50為（7.58±1.57）mg/L。

【關鍵詞】純種發酵；淡豆豉；異黃酮；MTT；MCF-7細胞；乳腺癌

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】A 【文章編號】1007-8517（2016）07-0023-05

Abstract：Objective To observe the inhibiting effect on isoflavones extracts from pure fermented Semen Sojae Praeparatum （SSP） to MCF-7 cells′ reproductive activity in vitro.Methods MCF-7 cells were cultured in vitro and interfered by different concentrations of isoflavones extracts from pure fermented SSP for 12，24，36，72 hours respectively. The inhibition of pure fermented SSP to MCF-7 cells were detected by MTT Method.Results （1）The isoflavones extracts from pure fermented SSP show the inhibition to MCF-7 cells compared with the negative control group，by different concentrations of 5mg/L，10mg/L，20mg/L，40mg/L for 12h，24h and 36 h （P<0.05），except 24h 10mg/L. （2） Pure fermented SSP could markedly inhibit proliferation of MCF-7 cell line in a time-dependent and dose-dependent manner. The effects of Pure fermented SSP were no difference compared with those of soy isoflavones（P>0.05）.Conclusion The results proved the inhibition of isoflavones extracts from pure fermented SSP show the best inhibiting effect on the proliferation of MCF-7 cells， 24h IC50（7.58±1.57）mg/L.

Keywords：pure fermented， Semen SojaePraeparatum， isoflavones， MTT， breast cancer

淡豆豉是一味以大豆為原材料經發酵而成的傳統中藥，始載于《名醫別錄》，有解表除煩、宣發郁熱之功效，適用于感冒、寒熱、頭痛、煩躁、胸悶及虛煩不眠等癥[1]，現已廣泛應用于成藥之中，如維C銀翹片、銀翹解毒片等。傳統制作淡豆豉的方法見于藥典，使用桑葉、青蒿的煎煮液浸泡大豆晾干后，再用桑葉、青蒿覆蓋初步發酵，再放入容器發酵近20d后得淡豆豉，其制法繁瑣、耗時，缺乏劑量標準，量產需要制作經驗，且發酵中易受其他微生物的干擾導致失敗、甚至產生毒素，這些都直接影響淡豆豉的品控、量產。本實驗前期分離得到高效淡豆豉發酵菌株，量化并優化發酵工序，僅需7d即能高效、安全、穩定獲得大量純種發酵淡豆豉[2-3]。乳腺癌作為女性三大惡性腫瘤之一，嚴重危害婦女健康。大量流行病學研究發現，亞洲人群經常食用富含植物雌激素的食物，其乳腺癌發病率較歐美人群明顯降低，而大豆及其相關制品如豆豉、納豆等則是植物雌激素的主要膳食來源[4-5]，植物雌激素主要包含異黃酮類如大豆苷元、染料木素、木酚類等。有眾多文獻指出[6-8]，大豆異黃酮對體外癌細胞有抗腫瘤作用。進一步研究顯示大豆異黃酮中游離形式生物活性相對非游離型要高，但僅占大豆總異黃酮的2%～3%。大豆發酵后的淡豆豉總異黃酮量與大豆相當，但游離形式苷元是大豆中的10～40倍[9]。因此，淡豆豉可能具有更加理想的防治乳腺癌作用。

目前國內外學者對中藥淡豆豉抗腫瘤功能的研究相對不多，對于純種發酵淡豆豉對人乳腺癌細胞（MCF-7）的研究更加少見，純種發酵淡豆豉對MCF-7細胞的生長影響如何則需進一步研究。本研究選用前期分離的高效淡豆豉發酵菌株，并采用前期得出的優化發酵條件發酵得到純種發酵淡豆豉，通過一定的提取方法獲得單位質量活性物質較高的純種發酵淡豆豉異黃酮提取物，用高效液相色譜法測定提取物主要有效成分含量，以大豆異黃酮作為陽性藥物，使用MTT法檢測其對MCF-7癌細胞的生長影響，為進一步擴展純種發酵淡豆豉的臨床應用提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人乳腺癌MCF-7細胞株，購于中國典型培養物保藏中心。

1.1.2 試劑 DMEM-H培養基（HyClone公司）；胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（Solarbio公司）；四甲基偶氮唑藍（MTT）（Solarbio公司）；0.02%EDTA/0.25%胰蛋白酶（M&C Gene Technology）；實驗所使用其他化學試劑均為分析純級，購于化學試劑公司。

1.1.3 藥物 陽性藥物大豆異黃酮購于江萊生物公司（精密級，80%），批號：JL 150208005；純種發酵淡豆豉異黃酮提取物由本課題組制備及提取。

1.1.4 儀器 CO2培養箱（Thermo公司USA3131型）；離心機（Thermo公司X1R型）；自動酶標儀（Thermo公司1510型）；倒置顯微鏡（DSZ2000X型）；全自動高壓滅菌鍋（TOMY公司SX-700型）；高效液相色譜儀HPLC（Agilent公司1260型）；色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；水浴振蕩器；水浴鍋；分析天平；烘箱；96孔培養板及T25細胞培養瓶（Corning公司）；移液器（大龍興創實驗儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 純種發酵淡豆豉的制備 購于市場的干大豆，經篩選、室溫清水浸泡（12h）后，使干黃豆充分吸收水分膨脹，晾干，按一定質量分裝到大三角燒瓶內，經15min，115℃處理后冷卻，在超凈臺內無菌操作，接種高效淡豆豉發酵菌液（按大豆30g∶菌液10ml比例）充分混勻后，于25℃溫箱培養發酵7d，獲得純種發酵淡豆豉。

1.2.2 純種發酵淡豆豉異黃酮提取物的制備 將純種發酵淡豆豉于60℃干燥回收，粉碎，過40目篩，稱取粉末200g，用石油醚脫脂，減壓干燥得到粉末，取100g加入pH=5緩沖液1000ml（由0.2mol/L檸檬酸鈉與0.1mol/L檸檬酸配制成），加入10mg β-葡萄糖苷酶、1000ml乙酸乙酯，45℃、超聲60min，減壓干燥得異黃酮粗品，按粗品、大孔樹脂1∶40比例上AB-8大孔樹脂柱乙醇反復洗脫，濃縮、干燥得純種發酵淡豆豉異黃酮提取物。

1.2.3 純種發酵淡豆豉異黃酮提取物主要成分含量測定 參照文獻[10]，使用高效液相色譜（HPLC）法測定提取物異黃酮含量，色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），大豆苷元測定條件：流動相∶甲醇∶水∶乙酸=45∶55∶1；檢測波長：250nm；柱溫：30℃；流速1ml/min；進樣量：10μl。染料木素測定條件：流動相∶甲醇∶水∶乙酸=45∶65∶1；檢測波長：262nm；柱溫：30℃；流速1ml/min；進樣量：10μl。精密稱取標準品大豆苷元（daidzein，5.25mg）、染料木素（genistein，5.55mg），加80%甲醇溶解，定容至50ml，得0.105 mg/ml 大豆苷元對照品溶液、0.111 mg/ml染料木素標準品溶液。

分別精密稱取精密稱取純種發酵淡豆豉異黃酮提取物0.5g，用10ml含有2mol/L鹽酸的80%乙醇溶解大豆苷元樣品，用10ml 80%乙醇溶解染料木素樣品，均超聲15min，4000r/min 離心5min，重復兩次，分別合并提取液，水浴蒸干，用80%的乙醇定容至10ml并經0.45μm膜過濾備用。

1.2.4 藥物組的配置 精密稱取1mg純種發酵淡豆豉異黃酮提取物，充分溶解于5ml無水乙醇中，加入20ml DMEM-H（不加FBS）培養液稀釋上述液體，得20%乙醇混合液，經0.22μm膜過濾，用DMEM-H（不加FBS）培養液稀釋得到濃度為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/L共8個濃度異黃酮提取物溶液，同樣方法精密稱取1mg大豆異黃酮制備以上8個濃度，全部密封、4℃避光保存備用。

1.2.5 MCF-7細胞的體外培養 將貼壁生長的MCF-7細胞經0.02%EDTA/0.25%胰酶（2∶1）混合液消化脫壁后按一定量接種至DMEM-H培養液（含10%FBS）中吹散均勻，移入新細胞培養瓶，于37℃、5%CO2培養箱中培養，每3～4d傳代1次，每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，及時剔除污染、死亡的細胞，本次實驗選用第四代細胞。

1.2.6 MTT實驗 實驗設對照組、空白組、不同濃度陽性對照組、不同濃度藥物組。取對數生長期的MCF-7細胞，倒出培養液，用適量PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗培養瓶底壁后吸出丟棄，加入0.02%EDTA/0.25%胰酶1ml，混勻，于37℃消化2～3min，倒置顯微鏡下觀察約80%細胞變圓時加入DMEM-H（含10%FBS）培養液3ml，輕輕反復吹打沖洗培養瓶底壁，經收集離心后用DMEM-H（含10%FBS）培養液調整單細胞懸液濃度為4×104個/ml。以每孔100μl接種96孔板，培養12h使細胞貼壁生長鋪滿底部，然后給以不同濃度藥物組各100μl，對照組加入100μl 20%乙醇（DMEM-H培養液稀釋，不含FBS），空白組則加入100μL DMEM-H培養液（含10%FBS），每組設3個平行孔，于37℃、5%CO2孵化箱培養。分別培養12、24、36、48、72h后，取出，每孔加入5mg/ml MTT（由PBS配成5mg/ml濃度） 20μl，繼續培養4h后，吸出培養基，每孔加入150μl DMSO，于低速搖床10min，靜置20min，于酶標儀測490nm各孔吸光度OD值。

生長抑制率（IR）=（1-藥物組OD值/對照組OD值）×100%

公式中藥物組為給予不同濃度的藥物實驗組，對照組為不加藥物處理的對照組。

1.3 統計學處理 實驗數據以（x±s）表示，采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，顯著性檢驗用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 純種發酵淡豆豉異黃酮提取物含量測定結果 通過HPLC法檢測得到兩種異黃酮標準品與樣品HPLC分離色譜圖（圖1～4），根據兩種標準品的線性范圍配制樣品溶液濃度，分別精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，每樣品3針。用外標法計算并換算純種發酵淡豆豉異黃酮提取物中大豆苷元、染料木素的平均含量為（26.06±0.82）mg/g、（54.65±0.74）mg/g，純種發酵淡豆豉異黃酮提取物的異黃酮含量約為（8.07±0.09）%。

2.2 純種發酵淡豆豉異黃酮提取物對MCF-7細胞的生長影響 純種發酵淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細胞12、24、36h后，其濃度5、10、20、40mg/L（除24h 10mg/L外）均表現出對MCF-7細胞穩定的抑制作用，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。隨藥物濃度升高，作用時間的延長，其抑制作用逐漸增強。在作用MCF-7細胞48h后，藥物組對MCF-7細胞抑制作用出現反復，作用MCF-7細胞72h后抑制率反而整體上升。（圖5～6）（表1～2）。

2.3 兩種藥物對MCF-7細胞生長影響的比較 根據2.2分析結果，采用純種發酵淡豆豉異黃酮提取物4個濃度（5、10、20、40mg/L）與同濃度陽性藥物大豆異黃酮在不同時段（12、24、36h）對MCF-7細胞抑制率的研究，采用重復測量設計資料的方差分析。實驗數據滿足Mauchly球形假設（P>0.05），直接采用重復測量方差分析。純種發酵淡豆豉異黃酮提取物組與大豆異黃酮組相比較，兩者對MCF-7細胞的抑制作用組間之間差異無統計學意義（F= 1.167，P=0.373）。純種發酵淡豆豉異黃酮提取物組與對照組相比，兩者對MCF-7細胞的抑制作用組間之間差異有統計學意義（F=7.327，P=0.004）。即在上述濃度范圍，純種發酵淡豆豉異黃酮提取物有與大豆異黃酮類似的作用，對MCF-7細胞增殖有抑制作用（圖7）。

3 討論

乳腺癌的病因目前尚未定論，病因學研究顯示可能與遺傳、免疫、環境、飲食等因素有關，比較公認且經多年研究證實的，即為乳腺癌為一種雌激素依賴性腫瘤，內源性雌激素水平持續升高或外源性雌激素大量補充，導致雌激素長期暴露都會增加乳腺癌發生的概率[11]。植物雌激素類物質是一類源于植物、活性與雌激素相似的雜環多酚類天然化合物，能與人體內的雌激素受體（ER）結合從而引發雌激素效應，但其結合率、效能遠遠低于雌激素，但又占據雌激素受體，從而消減了雌激素長期暴露作用，起到預防、治療乳腺癌的作用。

實驗結果表明，純種發酵淡豆豉異黃酮提取物中大豆苷元、染料木素的含量達（26.06±0.82）mg/g、（54.65±0.74）mg/g，總異黃酮含量約為（8.07±0.09）% 。與其他類似文獻[12-13]所公布的自然發酵淡豆豉提取物異黃酮含量相比，純種發酵淡豆豉提取物所獲得的異黃酮含量遠遠高于其他，說明純種發酵法與其他類方法相比，更加優越，值得推廣。

在作用MCF-7細胞12、24、36h內，純種發酵淡豆豉異黃酮提取物在5、10、20、40mg/L濃度對MCF-7細胞表現出顯著的抑制作用（P<0.05），且其抑制作用與藥物濃度、作用時間呈正相關。淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細胞24h的IC50為（7.58±1.57）mg/L（表1）。與大豆異黃酮組對MCF-7細胞的抑制作用無明顯差異（P>0.05）），表明有效含量約8%的純種發酵淡豆豉異黃酮提取物與有效含量約80%的大豆異黃酮具有相似的抑制作用，側面證明純種發酵淡豆豉所含異黃酮類活性成分較大豆異黃酮高。純種發酵淡豆豉異黃酮類物質與MCF-7細胞接觸后，抑制效果立刻產生，則可能與持續占據ER導致MCF-7細胞增殖能力下降有關。上述結果說明純種發酵淡豆豉具有明顯的抗乳腺癌的作用。

實驗中藥物干預MCF-7細胞48h、72h后出現各藥物組抑制率不再呈類線性關系，而在72h后各組抑制率反而明顯抬升，并不能說明此時藥物對抑制率產生主導作用。MTT法檢細胞抑制率其本質包括了增殖受限細胞和死亡細胞，在96孔板中培養48h、72h的細胞，其生長環境不再適宜、營養成分殆盡、代謝物積累、壞死細胞內容物的釋放等都使細胞增殖受限，同時可誘發細胞凋亡，因此數據分析時，不采用48h、72h的數據。

綜上所述，純種發酵淡豆豉具有明確的抗乳腺癌的作用。其對人乳腺癌MCF-7細胞抑制作用與純種發酵淡豆豉濃度、作用時間呈正相關， 24h的IC50為（7.58±1.57）mg/L。純種發酵淡豆豉發揮抗乳腺癌作用的機制還需進一步的深入研究。

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（收稿日期：2016.02.02）