清熱活血方對潰瘍性結腸炎模型小鼠β-catenin、Cdx1、Cdx2表達影響的研究

李華燕，李　斌，黃建斌，陳　玉，張　濤

(1. 廣東省江門市第二人民醫院，廣東 江門 529050；2. 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011)

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論著

清熱活血方對潰瘍性結腸炎模型小鼠β-catenin、Cdx1、Cdx2表達影響的研究

李華燕1，李斌1，黃建斌1，陳玉2，張濤2

(1. 廣東省江門市第二人民醫院，廣東 江門 529050；2. 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011)

[摘要]目的觀察清熱活血方對潰瘍性結腸炎模型小鼠結腸黏膜組織中β-catenin、Cdx1、Cdx2表達的影響，探討該方防治潰瘍性結腸炎的可能機制及其效應靶點。方法將100只雄性Balb/c小鼠隨機分為正常組、模型組、清熱活血方低劑量組、清熱活血方中劑量組及清熱活血方高劑量組，除正常組外，其余組采用自由飲用3%DSS 2周法制備潰瘍性結腸炎模型。自第3周起，正常組、模型組給予等劑量生理鹽水，各給藥組分別給予清熱活血方3.3 g/kg、6.6 g/kg、13.2 g/kg灌胃，均連續1周。末次給藥后處死全部小鼠，應用HE染色法檢測結腸黏膜組織病理學變化；應用免疫組化及熒光定量PCR技術檢測結腸黏膜組織中β-catenin、Cdx1、Cdx2表達情況；應用免疫熒光染色法檢測結腸黏膜組織中β-catenin核內轉位變化。結果光鏡下可見模型組結腸黏膜上皮脫落，大量炎性細胞浸潤及潰瘍形成；而各給藥組結腸黏膜充血、腫脹、上皮細胞脫落及成纖維母細胞表達增加，黏膜固有層可見少許炎性細胞浸潤，未見明顯潰瘍。與正常組比較，模型組小鼠結腸黏膜中β-catenin、Cdx1、Cdx2表達明顯增加(P均<0.05)；與模型組比較，各給藥組β-catenin、Cdx1、Cdx2陽性表達明顯減少(P均<0.05)。模型組小鼠結腸黏膜中β-catenin存在膜表達缺失、核內異常轉位現象，而各給藥組小鼠結腸黏膜中β-catenin表達以細胞膜為主，核內表達減少，部分可見核內異常轉位。結論清熱活血方可能通過促進β-catenin降解，下調Cdx1、Cdx2表達，調控腸上皮細胞增殖，修復腸黏膜屏障而發揮緩解潰瘍性結腸炎的效用。

[關鍵詞]β-catenin信號；潰瘍性結腸炎；清熱活血方；Cdx1；Cdx2

生理情況下，結腸細胞凋亡主要發生在腸腔上皮細胞，而活動期潰瘍性結腸炎患者，除腸腔上皮細胞外，病變處及鄰近的非病變處隱窩上皮細胞的凋亡增加，從而使由上皮細胞構成的黏膜屏障破壞，導致了結腸黏膜的損傷、潰瘍甚至癌變。目前越來越多的證據提示[1]，結腸上皮細胞的凋亡異常是導致潰瘍性結腸炎結腸組織損傷和免疫紊亂的重要機制之一。課題組前期研究亦發現，腸上皮細胞凋亡加速和炎性細胞凋亡延緩導致腸黏膜屏障完整性破壞，炎癥持續在潰瘍性結腸炎發生、發展中占據重要地位[2-3]。在“濕熱毒瘀”貫穿疾病始終的前提下，應用清熱活血類方藥干預潰瘍性結腸炎研究證實，該方具有明確緩解潰瘍性結腸炎、促進黏膜愈合質量的效用[4]，但是關于其具體作用靶點尚未明確，由此課題組在中醫藥理論指導下，基于現代醫學研究進展，擬從β-catenin信號介導Cdx1、Cdx2表達參與腸上皮細胞修復角度，探討健脾清熱活血類方藥干預潰瘍性結腸炎的可能靶點。

1實驗資料

1.1實驗動物4周齡雄性Balb/c小鼠100只，體質量(18±2)g，購自湖南斯萊克實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(湘)2011-0003，動物合格證號：4304701479。

1.2試劑與儀器葡聚糖硫酸鈉(DSS，貨號D8903)購自Sigma，Cdx1、Cdx2、β-catenin一抗購自美國SanTa，二抗購自博士德生物公司，無水乙醇、甲醛、戊二醛、生理鹽水等購自廣東國藥控股，ABI7500熒光定量PCR儀，Bio-Rad全自動酶標儀以及倒置相差顯微鏡(蔡司)，Cdx1、Cdx2、β-catenin引物合成由上海生工生物技術有限公司完成。

1.3實驗藥物清熱活血方由白術10 g、炙甘草6 g、馬齒莧15 g、白芍15 g、土鱉蟲10 g、三七10 g組成，專人對組成藥味進行產地確證、品種鑒定、品質評價，確保藥材質量規范化。用蒸餾水煎成中藥藥液，濃縮配制成1 g原生藥/1 mL的藥液，過濾除菌分裝4 ℃保存備用。

1.4實驗方法

1.4.1造模及分組給藥將100只雄性Balb/c小鼠隨機分為正常組、模型組、清熱活血方低劑量組、清熱活血方中劑量組及清熱活血方高劑量組，每組20只。參照文獻[5-6]，全部小鼠適應性喂養1周，除正常組同步飼養外，其余組采用自由飲用3%DSS 2周法制備潰瘍性結腸炎模型。自第3周起，正常組、模型組給予等劑量生理鹽水，各給藥組分別給予清熱活血方3.3 g/kg、6.6 g/kg、13.2 g/kg灌胃(按人與小鼠體質量折算)，均連續1周。

1.4.2指標檢測末次給藥后2 h，處死全部小鼠，剪取從回盲部至直腸全部腸段，分別置于甲醛、電鏡固定液及液氮中備測。①采用HE染色法，檢測結腸黏膜組織病理學變化，具體實驗步驟按說明進行。 ②采用免疫組化SABC法檢測小鼠結腸黏膜組織中β-catenin、Cdx1、Cdx2蛋白表達情況，具體實驗步驟嚴格按照試劑盒說明進行，由2名病理科醫生進行盲評分析，分析軟件為Image pro plus 9.0。③應用Real-time PCR技術檢測β-catenin、Cdx1、Cdx2 mRNA表達變化，具體步驟按試劑盒說明操作。在GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS區設計特異性引物。β-catenin引物序列：上游為5’-CTCTGGGGCTGGCTGTAGAC -3’，下游為5’-ACATCTCCTCCGGACTCTTCC -3’， 擴增長度169 bp；Cdx1引物序列：上游為5’-ACGCTGACGAAAGTGTTGGT-3’，下游為5’-TCTGGGTTTTCCGGGGTAGC -3’， 擴增長度107 bp；Cdx2引物序列：上游為5’-CCTGGATGCTGGAGGTCTGT -3’，下游為5’-CGGCTCTTCTTCAAGGGCTC -3’， 擴增長度128 bp； GAPDH引物序列：上游為5’-GTTGTCTCCTGCGACTTCA -3’，下游為5’-GCCCCTCCTGTTATTATGG -3’， 擴增長度93 bp。④采用免疫熒光顯微鏡檢測小鼠結腸黏膜中β-catenin核內轉位變化，具體實驗委托廣州達安基因生物有限公司完成。

2結果

2.1小鼠結腸黏膜組織病理學表現正常組小鼠結腸黏膜下層輕度血管擴張，少量炎細胞浸潤，結腸壁各層結構均正常；模型組小鼠結腸壁黏膜面見巨大潰瘍，腸壁各層充血、水腫，大量炎細胞浸潤；各給藥組小鼠結腸黏膜病理變化無明顯差異，均見結腸壁黏膜及黏膜下層輕度充血水腫，少量炎細胞浸潤及成纖維母細胞增加。見圖1～5。

圖1　正常組小鼠結腸黏膜組織病理學表現(×20)

2.2小鼠結腸黏膜組織中β-catenin、Cdx1、Cdx2蛋白表達情況與正常組比較，模型組小鼠結腸黏膜組織中β-cate-nin、Cdx1、Cdx2陽性表達明顯增加(P均<0.05)；與模型組比較，各給藥組β-catenin、Cdx1、Cdx2陽性表達明顯減少(P均<0.05)。見圖6～20及表1。

圖2　模型組小鼠結腸黏膜組織病理學表現(×20)

圖3　清熱活血方低劑量組小鼠結腸黏膜組織病理學表現(×20)

圖4　清熱活血方中劑量組小鼠結腸黏膜組織病理學表現(×20)

圖5　清熱活血方高劑量組小鼠結腸黏膜組織病理學表現(×20)

2.3小鼠結腸黏膜中β-catenin 、Cdx1、Cdx2 mRNA表達情況與正常組比較，模型組小鼠結腸黏膜中β-catenin、Cdx1、Cdx2 mRNA表達明顯增加(P均<0.05)；與模型組比較，各給藥組β-catenin、Cdx1、Cdx2 mRNA表達明顯減少(P均<0.05)。見表2。

2.4小鼠結腸黏膜中β-catenin核內轉位情況模型組小鼠結腸黏膜中β-catenin存在膜表達缺失、核內異常轉位現象；而各給藥組小鼠結腸黏膜中β-catenin表達以細胞膜為主，核內表達減少，部分可見核內異常轉位。見圖21～25。

圖6　正常組小鼠結腸黏膜中β-catenin蛋白表達情況(×10)

圖7　模型組小鼠結腸黏膜中β-catenin蛋白表達情況(×10)

圖9　清熱活血方中劑量組小鼠結腸黏膜中β-catenin蛋白

3討論

中醫學按癥狀將潰瘍性結腸炎歸屬于“久痢” “休息痢”范疇，本課題組結合臨床實踐，在中醫學指導下認為“濕熱毒瘀”是潰瘍性結腸炎發生的內在本質，濕熱內盛，聚濕成痰，痰隨氣而升無處不至，日久阻塞經絡，化為瘀血，痰瘀互結，損傷腸絡，“初病在經，久病入絡”，此之謂也。氣血阻滯腸絡，局部則為黏膜循環障礙，缺氧、缺血，腸黏膜屏障功能低下，食物抗原及內生抗原更易侵入，造成腸上皮細胞損傷，不斷修復，重構異常，以致炎癥反復發作。故根據上述病機確立清熱活血、解毒化瘀為治療潰瘍性結腸炎基本大法。清熱活血方以白術健脾益氣、燥濕利水為君藥，佐以炙甘草增強其健脾益氣之功效；馬齒莧具有瀉火解毒、清熱利濕、行氣止痛、涼血止血之功；白芍配炙甘草具有緩急止痛、調和肝脾之效；土鱉蟲破瘀消腫、蕩滌積滯；三七化瘀止血、通絡止痛、行守兼備、去腐生新；諸藥合用共奏清熱解毒化濕、活血定痛止血之功[7]。本研究發現光鏡下可見模型組小鼠結腸黏膜上皮脫落，大量炎性細胞浸潤及潰瘍形成；而各給藥組小鼠結腸黏膜輕度充血腫脹，成纖維母細胞增加，黏膜固有層可見少許炎性細胞浸潤，未見明顯潰瘍。這說明清熱活血方具有明確緩解潰瘍性結腸炎的效用。

圖10　清熱活血方高劑量組小鼠結腸黏膜中β-catenin蛋白

圖11　正常組小鼠結腸黏膜中Cdx1蛋白表達情況(×10)

圖12　模型組小鼠結腸黏膜中Cdx1蛋白表達情況(×10)

圖13　清熱活血方低劑量組小鼠結腸黏膜中Cdx1蛋白

圖14　清熱活血方中劑量組小鼠結腸黏膜中Cdx1蛋白

圖15　清熱活血方高劑量組小鼠結腸黏膜中Cdx1蛋白

圖16　正常組小鼠結腸黏膜中Cdx2蛋白表達情況(×10)

圖17　模型組小鼠結腸黏膜中Cdx2蛋白表達情況(×10)

圖18　清熱活血方低劑量組小鼠結腸黏膜中Cdx2蛋白

圖19　清熱活血方中劑量組小鼠結腸黏膜中Cdx2蛋白

圖20　清熱活血方高劑量組小鼠結腸黏膜中Cdx2蛋白

β-catenin是Wnt/Wingless信號途徑的關鍵信號分子，Wnt配體通過與frizzled受體以及低密度脂蛋白受體相關蛋白5和6(LRP5和LRP6) 結合,引起disheveled蛋白(DVL)的磷酸化而啟動該信號通路；繼而磷酸化的DVL與Axin 和腫瘤抑制基因APC(adenomatous polyposis coli) 共同阻止糖原合酶激酶(GSK-3β) 對β-catenin的磷酸化[8-9]。沒有磷酸化的β-catenin則不被降解系統所識別,最終進入細胞核,并與轉錄因子TCF4 結合,從而激活下游靶基因Cdx轉錄[10]。

表1　各組小鼠結腸黏膜中β-catenin、Cdx1、Cdx2蛋白陽性表達情況 μm2)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表2　各組小鼠結腸黏膜中β-catenin 、Cdx1、Cdx2 mRNA表達情況 μm2)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

圖21　正常組小鼠結腸黏膜中β-catenin核內轉位情況

圖22　模型組小鼠結腸黏膜中β-catenin核內轉位情況

圖23　清熱活血方低劑量組小鼠結腸黏膜中β-catenin核內轉位情況

圖24　清熱活血方中劑量組小鼠結腸黏膜中β-catenin

圖25　清熱活血方高劑量組小鼠結腸黏膜中β-catenin

Cdx基因隸屬尾狀同源異形框基因家族，包含3個同源基因，即Cdx1、Cdx2和Cdx4，其中Cdxl基因和Cdx2基因在正常生物體發育過程中對于腸上皮細胞的增殖和分化具有重要作用[11]。Wnt途徑調節Cdx1和Cdx2的表達，Cdx1被證明是Wnt途徑的靶基因；Cdx2基因的表達被Wnt途徑的靶基因SOX9所阻斷[12]。本研究發現，模型組小鼠結腸黏膜中β-catenin存在膜表達缺失、核內異常轉位現象，其結腸黏膜中β-catenin、Cdx1、Cdx2表達增加；各給藥組小鼠結腸黏膜中β-catenin表達以細胞膜為主，核內表達減少，部分可見核內異常轉位，并見結腸黏膜中β-catenin、Cdx1、Cdx2表達減少。

綜上所述，筆者推測清熱活血方可能通過促進β-cate-nin降解，下調Cdx1、Cdx2表達，調控腸上皮細胞增殖，修復腸黏膜屏障而發揮緩解潰瘍性結腸炎的效用。

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Study on the effect of Qingre Huoxue decoction on the expression of β-catenin, Cdx1 and Cdx2 in ulcerative colitis rat models

LI Huayan1,LI Bin1,HUANG Jianbin1,CHEN Yu2,ZHANG Tao2

(1.The Second People’s Hospital of Jiangmen,Jiangmen 529050, Guangdong, China;2.Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanning 530011, China)

Abstract:Objective It is to explore observe the effect of Qingre Huoxue decoction on the expression of β-catenin,Cdx2 and Cdx1 in the treatment of ulcerative colitis rat models, thus to explore the possible mechanism and effect target point of this treatment. Methods 100 Balb/c rats were randomly divided into normal group, blank group, low , middle and high dosage groups of Qingre Huoxue decoction. All the rats in every group except normal group were used to establish ulcerative colitis models by drinking 3% DSS for 2 weeks. Since the 3th week, the normal group and blank group was given the same dose of normal saline by intragastric administration, and every treatment group was treated with different dosage of Qingre Huoxue decoction (3.3 g/kg, 6.6 g/kg, 13.2 g/kg respectively) for one week. All rats were killed at the end of the last administration. The pathological changes of colonic mucosa were detected by HE staining. The expression of Cdx1,β-catenin and Cdx2 were detected by immunohistochemical staining and PCR. The changes of β-catenin in the nucleus were detected by immunofluorescence staining. Results In the blank group, there was a large number of inflammatory cell infiltration and ulcers under the light microscope. While in the treatment group, there was a little inflammatory cell infiltration with no ulcer in it. In the blank group, the β-catenin expression on cell membrane of colon mucosa was absent with abnormal nuclear translocation. And the expression of β-catenin, Cdx2 and Cdx1 increased in the colon mucosa. In treatment group, the expression of β-catenin was mainly in the cell membrane, and the expression of β-catenin, Cdx2 and Cdx1 in the colon mucosa was decreased. The differences were statistically significant(P<0.05). Conclusion Qingre Huoxue decoction may regulate the expression of Cdx1 and Cdx2 by the degradation of β-catenin in order to promote the proliferation of intestinal epithelial cells, with repairing the intestinal mucosal barrier and relieving the symptoms of ulcerative colitis.

Key words:β-catenin signaling way; ulcerative colitis; Qingre Huoxue decoction; Cdx1; Cdx2

[收稿日期]2015-11-25

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)11-1141-06

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.11.001

[基金項目]廣西自然科學基金資助項目(2013GXNSFAA011916)；江門市科技局資助項目(12A078)

[作者簡介]李華燕，女，副主任醫師，主要從事消化系疾病中西醫結合研究。[通信作者]張濤，E-mail:327664246@qq.com