SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達及意義

張　敏,宋殿榮，曹保利，劉　帥，劉晉津

(1. 天津中醫(yī)藥大學，天津 300100；2. 天津市南開醫(yī)院，天津 300100；3. 天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300000)

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SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達及意義

張敏1,2,宋殿榮3，曹保利2，劉帥1，劉晉津2

(1. 天津中醫(yī)藥大學，天津 300100；2. 天津市南開醫(yī)院，天津 300100；3. 天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300000)

[摘要]目的探討基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)、趨化因子受體-4(CXCR4)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織中的表達情況及意義。方法取50例子宮肌瘤患者正常子宮內(nèi)膜組織標本作為正常組，50例子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜組織和異位內(nèi)膜組織標本分別作為在位組和異位組。采用免疫組化法及PCR技術(shù)檢測SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF在各組的表達情況。結(jié)果SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織、在位內(nèi)膜組織及正常子宮內(nèi)膜組織腺上皮細胞和間質(zhì)細胞中均有表達，以腺上皮表達為著。異位組SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF平均光密度值和SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA、MMP-9 mRNA、VEGF mRNA表達量均明顯高于在位組和正常組(P均<0.05)，而在位組高于正常組(P均<0.05)。結(jié)論SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF的高表達與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病相關，推測SDF-1、CXCR4高表達可能直接或通過其他相關通路影響MMP-9及VEGF的表達而參與子宮內(nèi)膜異位癥的侵襲和血管形成過程，為子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制及診治提供了更深入的靶點。

[關鍵詞]子宮內(nèi)膜異位癥；基質(zhì)細胞衍生因子；趨化因子受體-4；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；血管內(nèi)皮生長因子

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是育齡婦女的常見病、多發(fā)病, 其發(fā)病機制研究眾說紛紜，而不管哪種學說，黏附—侵襲—血管生成都是其基本病理過程，但能促進異位子宮內(nèi)膜黏附、侵襲和血管生成的確切機制尚不清楚。該病雖為良性疾病, 但具有與惡性腫瘤相似的侵襲性[1]。基質(zhì)細胞衍生因-1(SDF-1)、趨化因子受體-4(CXCR4)是近年來研究較多的與腫瘤發(fā)病相關的因子，兩者特異性結(jié)合后形成的SDF-1/CXCR4在腫瘤細胞的遷移、侵襲、增殖及血管形成過程中發(fā)揮重要的生物學作用[2-3]。本研究以免疫組化法、PCR法檢測了SDF-1、CXCR4、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中的表達情況，旨在探討各指標與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的關系及意義。

1研究資料

1.1一般資料收集2014年9月—2015年9月在天津市南開醫(yī)院婦產(chǎn)科因腺肌癥合并內(nèi)異癥接受子宮切除術(shù)的50例患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織標本各50份分別作為在位組和異位組，另選擇同期因子宮肌瘤手術(shù)的 50 例正常子宮內(nèi)膜組織標本作為正常組。所有患者均無內(nèi)科合并癥，術(shù)前3個月內(nèi)未服用激素類藥物。所有標本獲得均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準并取得患者知情同意,并均經(jīng)腹腔鏡或開腹手術(shù)及組織病理證實,均有完整的臨床及病理資料。

1.2研究方法

1.2.1免疫組化法檢測SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF在各組織標本中表達情況標本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片后脫蠟;配制PBS浸泡5 min；熱抗原修復(pH值6.0)；3%過氧化氫去離子水孵育10 min以消除內(nèi)源性過氧化酶活性；滴加山羊血清工作液封閉，室溫孵育15 min；分別滴加1∶100比例稀釋的SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF一抗，4 ℃孵育過夜;加入相應的二抗，37 ℃孵育15 min;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育15 min；DAB 顯色，蘇木素復染、脫水、透明、封片。每步均經(jīng)PBS洗滌3次，每次5 min。免疫組化染色采用S-P法，操作具體步驟按試劑盒說明書進行。山羊抗人SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF試劑盒均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。采用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)對SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF免疫組化切片進行圖像分析處理，以胞漿見棕黃色顆粒為陽性染色細胞。采用彩色自動圖像分析軟件對染色結(jié)果進行分析，每張切片保持光線強度不變，低倍鏡下先選取異位病灶區(qū)，高倍視野(×400)輸入計算機進行分析，以平均光密度值作為SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF的相對表達強度，每張切片隨機觀察5個視野，然后取平均值作為每張切片的觀察結(jié)果。

1.2.2RT-PCR方法檢測SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA、MMP-9 mRNA及VEGF mRNA在各組織標本中表達水平引物設計： SDF-1上游序列為5’-CCATGAACGCCAAGGTCGTGGTC-3’,下游序列為5’-AGGGCATGGATGAATATA-3’；CXCR4上游序列為5’-AGGTGGTCTATGTTGGCGTCTGGAT-3’,下游序列為5-AGGATGGGGATGATTGTGGTCTTGA-3’；MMP-9上游序列為5’-GGTGGACCGGATGTTCCC-3’,下游序列為5’-GCCCACCTCCACTCCTCC-3’；VEGF上游序列為5’-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3’,下游序列為： 5’-CCTGGTGAGAGATCTGGTTC-3’；內(nèi)參對照物β-actin上游序列為5’-AAGAGAGGCATCCTCACCCT-3’,下游序列為5’-GGAAGGAAGGCTGGAAG-3’。用TRIzol抽提組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴增SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF，并擴增β-actin作為內(nèi)參物，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNA提取試劑購自天津生化科技北京有限公司。β-actin和SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF引物以及熒光定量PCR試劑盒購于天津生化科技北京有限公司。反應條件： 94 ℃預變性2 min,1個循環(huán);94 ℃變性20 s,35個循環(huán)；SDF-1,CXCR4,MMP-9及VEGF、內(nèi)參β-actin分別55 ℃退火30 s，20 s,35個循環(huán)；68 ℃延伸1 min,共35個循環(huán)。

2結(jié)果

2.1免疫組化結(jié)果SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織、在位內(nèi)膜組織及正常子宮內(nèi)膜組織腺上皮細胞和間質(zhì)細胞中均有表達，以腺上皮表達為著，且陽性部位定位于細胞漿。異位組SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF平均光密度值均明顯高于在位組和正常組(P均<0.05)，而在位組高于正常組(P均<0.05)。3組各指標表達情況見圖1～12及表1。

圖1　異位內(nèi)膜中SDF-1表達情況(×400)

圖2　在位內(nèi)膜中SDF-1表達情況(×400)

2.2PCR檢測結(jié)果異位組SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA、MMP-9 mRNA、VEGF mRNA 表達量均明顯高于在位組和正常組(P均<0.05)，而在位組高于正常組(P均<0.05)。見表2。

3討論

SDF-1/CXCR4是近年來研究較多的與腫瘤發(fā)病相關的因子。SDF-1是CXC趨化因子亞家族的成員之一，CXCR4是SDF-1的特異性受體，二者特異性結(jié)合后形成的SDF-1/CXCR4具有增加腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)、基底膜等黏附、侵襲的作用[4]，是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移及形成的先決條件。研究表明，SDF-1與CXCR4 的相互作用激活了G蛋白,從而激活了 磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(PI3-K/Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)，即通過CXCL12/CXCR4-PI3K-MAPK-NF-κB通路進行信號轉(zhuǎn)導[5]，進而促進腫瘤細胞高表達基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等而提高腫瘤的侵襲能力[6]；且SDF-1與CXCR4的結(jié)合可以通過激活PI3K/AKT信號傳導途徑誘導VEGF的生成[7]，而VEGF與腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移密切相關。應用RNA技術(shù)敲除CXCR4基因后的CXCR4拮抗劑AMD3100，不僅在體外減少了VEGF的生成，而且在體內(nèi)也抑制了小鼠中轉(zhuǎn)移瘤的增殖生長及血管的形成[8-9]。說明SDF-1/CXCR4在腫瘤組織的侵襲和血管形成中擔著重要角色，其調(diào)節(jié)MMP-9及VEGF高表達而致病。

圖3　正常內(nèi)膜中SDF-1表達情況(×400)

圖4　異位內(nèi)膜中CXCR4表達情況(×400)

圖5　在位內(nèi)膜中CXCR4表達情況(×400)

圖6　正常內(nèi)膜中CXCR4表達情況(×400)

圖7　異位內(nèi)膜中MMP-9表達情況(×400)

圖8　在位內(nèi)膜中MMP-9表達情況(×400)

圖9　正常內(nèi)膜中MMP-9表達情況(×400)

圖10　異位內(nèi)膜中VEGF表達情況(×400)

圖11　在位內(nèi)膜中VEGF表達情況(×400)

圖12　正常內(nèi)膜中VEGF表達情況(×400)

組別nSDF-1CXCR4MMP-9VEGF異位組500.1923±0.04320.1730±0.09310.1594±0.09560.1382±0.0068在位組500.1411±0.0142①②0.1205±0.0029①②0.1220±0.0693①②0.0814±0.0239①②正常組500.0350±0.0537①0.0462±0.0040①0.0462±0.0106①0.0481±0.0089①

注：①與異位組比較,P<0.05；②與正常組比較,P<0.05。

表2　3組SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA、MMP-9 mRNA、VEGF mRNA表達量比較

注：①與異位組比較,P<0.05；②與正常組比較,P<0.05。

子宮內(nèi)膜異位癥的生物學特性與惡性腫瘤很相似，故本研究檢測了上述指標，以探討其發(fā)病機制。結(jié)果表明SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織、在位內(nèi)膜組織及正常子宮內(nèi)膜組織腺上皮細胞和間質(zhì)細胞中均有表達，以腺上皮表達為著；異位組SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF平均光密度值和SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA、MMP-9 mRNA、VEGF mRNA 表達量均明顯高于在位組和正常組，而在位組高于正常組。說明SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF的高表達與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病有關，推測SDF-1、CXCR4高表達可能直接或通過其他相關通路影響MMP-9及VEGF的表達而參與子宮內(nèi)膜異位癥的侵襲和血管形成過程，為子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制及診治提供了更深入的靶點。而SDF-1/CXCR4與MMP-9、VEGF之間相關性及調(diào)節(jié)機制仍不清楚，有待進一步研究。

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Expression and significance of SDF-1， CXCR4, MMP-9 and VEGF in human endometriosis

ZHANG Min1,2, SONG Dianrong3, CAO Baoli2，LIU Shuai1, LIU Jinjin2

(Tianjin University of TCM, Tianjin 300100, China; 2.Nankai Hospital of Tianjin, Tianjin 300100, China; 3.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM, Tianjin 300000, China)

Abstract:Objective It is to discuss the expression and significance of stromal cell derived by SDF-1 (SDF-1), chemokine receptors-4 (CXCR4), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis patients. Methods The normal endometrial tissue samples of 50 patients with uterine fibroids were selected as normal group,and eutopic and ectopic endometrial tissue samples of 50 cases with endometrium were used as eutopic and ectopic group respectively. The expression of SDF-1, CXCR4, MMP-9, VEGF in each group was detected by immunohistochemistry and PCR technology. Results SDF-1, CXCR4, MMP-9, VEGF were expressed in ectopic endometrium tissue, ectopic tissue, normal endometrial glandular epithelial cells and stromal cells in patients with endometriosis, and in glandular epithelium the expression was more obviously. Average optical density of ectopic group SDF-1, CXCR4, MMP-9, VEGF and SDF-1 mRNA, CXCR4 mRNA, MMP-9 mRNA, VEGF mRNA expression were significantly higher than those in eutopic and normal group (P<0.05), while the indexes in eutopic group were higher than that in normal group (P<0.05). Conclusion High expression of SDF-1 and CXCR4, MMP-9, VEGF is associated with endometriosis pathogenesis, and we speculated that high expression of SDF-1, CXCR4 may directly or indirectly influence the expression of MMP-9 and VEGF through other relevant pathways, thus participate in endometriosis invasion and angiogenesis, for providing a more in-depth targets in endometriosis pathogenesis, diagnosis and treatment.

Key words:endometriosis；SDF-1；CXCR4；MMP-9；VEGF

[收稿日期]2015-11-30

[中圖分類號]R711.71

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)11-1147-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.11.002

[基金項目]天津市衛(wèi)生和計劃生育委員會中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題(2015053)

[作者簡介]張敏，女，主治醫(yī)師，碩士，研究方向為子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制及中西醫(yī)結(jié)合診治。