川黃合劑對TNF-α誘導的人腹膜間皮細胞IL-6和IL-8表達的影響

朱桂松，傅元冬，陳暢泉

(江蘇省南京市中醫院，江蘇 南京 210001)

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川黃合劑對TNF-α誘導的人腹膜間皮細胞IL-6和IL-8表達的影響

朱桂松，傅元冬，陳暢泉

(江蘇省南京市中醫院，江蘇 南京 210001)

[摘要]目的探討川黃合劑對TNF-α誘導的體外培養的人腹膜間皮細胞(HPMCs)增殖及白細胞介素-6(IL-6)和IL-8表達的影響。方法體外培養HPMCs，用含1%胎牛血清的RPMI-1640培養液同步24 h后，分為空白對照組、TNF-α誘導組(1 μg/L)和低、中、高劑量川黃合劑干預組(n=3)。采用MTT法和流式細胞術檢測各組細胞的增殖情況；采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測細胞上清液中IL-6和IL-8蛋白含量，細胞沉淀用BCA蛋白檢測方法測定細胞蛋白質含量，用以校正ELISA結果。結果干預48 h后，3種濃度川黃合劑干預組的OD值、PI值均顯著高于TNF-α誘導組(P均<0.05)，且IL-6和IL-8蛋白表達水平均明顯低于TNF-α誘導組 (P均<0.05)。結論川黃合劑能增強炎癥狀態下HPMCs活性，并降低炎癥因子IL-6和IL-8的表達。

[關鍵詞]川黃合劑；生大黃；川芎；白細胞介素-6；白細胞介素-8；急性腹膜炎

急性腹膜炎是臨床常見急腹癥，治療不及時易引發全身炎癥反應綜合征(SIRS)/膿毒血癥(SEPSIS)并導致多器官功能障礙綜合征(MODS)或多臟器衰竭(MOF)，病死率極高[1]。多種炎癥因子參與腹膜炎的病理生理過程，其中最主要的促炎因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和某些白細胞介素家族成員如白細胞介素-6(IL-6)、IL-8，這些炎癥遞質在體內組成復雜龐大的細胞網絡，在炎癥反應時形成“瀑布式”釋放的級聯反應，誘導SIRS及MODS[2-3]。因此，治療腹膜炎的核心就是早期抑制炎癥因子的表達，阻斷失控的炎癥反應及細胞損害。根據中醫辨證論治原則，我院自擬川黃合劑(大黃和川芎配伍)治療腹膜炎取得了很好的臨床療效。本實驗旨在通過觀察川黃合劑對體外培養的人腹膜間皮細胞(HPMCs)在急性炎癥狀態下炎癥因子的干預作用，探討川黃合劑的抗炎效應以及對HPMCs的保護作用，為臨床應用川黃合劑提供實驗依據。

1實驗資料

1.1材料生大黃顆粒劑(1包相當于生藥10 g)，川芎(1包相當于生藥6 g)，由江陰天江藥業有限公司提供；磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FCS)、RPMI-1640粉劑等(Gibco公司)；胰蛋白酶(Promega公司)；IL-6、IL-8和ELISA試劑盒(ADL公司)；BCA蛋白含量檢測試劑盒(南京凱基生物科技公司)；抗細胞角蛋白抗體、抗細胞波形蛋白抗體、第Ⅷ因子抗體和抗白細胞CD45抗體(北京中山生物技術有限公司)；NU-2500E 二氧化碳培養箱(Nuaire)；全自動酶標儀(Biobank)。

1.2方法

1.2.1HPMCs的培養與鑒定取南京市中醫院普外科及肛腸科30例(排除腹膜炎)擇期腹部手術患者捐獻的大網膜組織，按標準方法原代培養HPMCs，按1∶3傳代，第3代細胞用于實驗。倒置相差顯微鏡觀察HPMCs呈多邊形，似鋪路鵝卵石樣外觀；免疫組化鑒定抗細胞角蛋白抗體和抗波形蛋白抗體染色陽性、抗第Ⅷ因子抗體和抗白細胞CD45抗體染色陰性。

1.2.2實驗步驟和分組生大黃顆粒、川芎顆粒各1包紫外線消毒，分別用滅菌注射用水60 mL溶解，備用。HPMCs用含1%FCS的RPMI-1640培養液同步24 h后分為5組(每組設3個樣本)，即空白對照組、TNF-α誘導組(1 μg/L)和TNF-α誘導加低、中、高劑量川黃合劑(生大黃終濃度分別為10，30，60 mg/L；川芎濃度分別為6，18，36 mg/L)干預組。各組完全培養液均為含有15%FCS的RPMI-1640培養液。細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱培養48 h。

1.2.3細胞毒性實驗川黃合劑中生大黃與川芎配伍比率選為10∶6，為了排除本實驗中所選擇的生大黃與川芎濃度對HPMCs本身產生毒性作用，對實驗濃度的川黃合劑進行了細胞毒性的觀察。步驟如下：用完全培養液將HPMCs以105個/mL濃度接種于24孔培養板中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h；然后再每孔加入生大黃終濃度分別為10，30，60 mg/L和川芎濃度分別為6，18，36 mg/L的川黃合劑，繼續培養24 h，顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.4活細胞數測定分組干預48 h后，吸棄舊培養液，加入MTT(5 mg/mL)繼續培養3 h，加DMSO振蕩混勻，置于自動酶標儀上，自動酶標儀以490 nm波長測定各孔的吸光度(OD)值，以OD 值表示HPMCs活性。

1.2.5細胞增殖情況檢測取干預48 h后的細胞，胰蛋白酶消化，每孔加入0.5 mL完全培養液重懸細胞；碘化丙啶室溫避光染色20 min，用流式細胞儀檢測細胞周期情況，Cell Quest軟件分析，用細胞分裂增殖指數(proliferation index,PI)表示相對增殖活力。計算公式為：PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2M) ×100%。

1.2.6細胞上清液中IL-6和IL-8蛋白含量檢測離心取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測IL-6和IL-8蛋白含量。用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶解細胞沉淀，BCA蛋白檢測試劑盒測定細胞沉淀中蛋白質濃度，用相應蛋白質濃度結果校正檢測結果。

2結果

2.1細胞毒性實驗本實驗所選劑量的川黃合劑無明顯毒性作用，細胞形態良好。

2.2各組HPMCs活性空白對照組MTT OD值為0.89±0.06，TNF-α誘導組為0.48±0.04，低劑量川黃合劑組為0.59±0.03，中劑量川黃合劑組為0.64±0.05，高劑量川黃合劑組為0.69±0.06。TNF-α誘導組細胞MTT OD值明顯低于空白對照組(P<0.05)；加用川黃合劑干預后， MTT OD值均顯著高于TNF-α誘導組(P均<0.05)。

2.3各組細胞增殖情況空白對照組HPMCs PI值為19.47±2.05，TNF-α誘導組為10.70±1.61，低劑量川黃合劑組為14.94±1.69，中劑量川黃合劑組為15.16±1.82，高劑量川黃合劑組為16.63±2.12。TNF-α誘導組PI值明顯低于空白對照組(P<0.05)；加用川黃合劑干預后，PI值均顯著高于TNF-α誘導組(P均<0.05)。

2.4各組上清液中IL-6和IL-8蛋白含量TNF-α誘導組上清液中IL-6和IL-8含量均明顯高于空白對照組(P均<0.05)；加用川黃合劑干預后，上清液中IL-6和IL-8含量均明顯低于TNF-α誘導組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組上清液中IL-6和IL-8蛋白含量

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與TNF-α誘導組比較，P<0.05。

3討論

急性腹膜炎可以是原發或繼發起病，如消化道穿孔、膽管穿孔、腹腔內器官損傷破裂或血運障礙壞死、重癥感染致腸道菌群移位等[4-5]。細菌和內毒素等抗原激活宿主單核巨噬細胞系統，后者釋放多種細胞因子，引起促炎和抗炎反應失衡，持續不受控制的炎癥反應即SIRS[2，6]。所以說，炎癥因子在腹膜炎的病理生理過程中占主導地位。目前認為TNF-α是炎癥反應的啟動因子[7-8]，而HPMCs作為腹膜表面的主要細胞層參與了炎癥反應過程[9]。近年來連續性腎臟替代治療(CRRT)等搶救技術有較大發展，但腹膜炎引起的SEPSIS及MODS的病死率仍然居高不下，這就使得臨床醫生不斷探索有效的聯合治療方法。

祖國醫學注重整體觀念，強調陰陽平衡，雙向調節機體免疫及器官功能狀態，在早期抑制炎癥反應、防治MODS、降低臨床病死率方面有積極意義[6]。在古代文獻中有類似急性腹膜炎癥候的記載，散見于“腸癰”“腹痛”“厥心痛”“厥逆”“結胸”“脾心痛”“腸結腹痛”“心腹痛”等的論述中。如《素問·至真要大論》記載：“厥陰之腹，少腹堅滿，里急暴痛……厥心痛，汗發嘔吐?！薄秱摗酚涊d“心下痛，按之石硬”、“從心下至少腹硬滿而痛，不可近”?！毒霸廊珪な冀浧吩疲骸柏誓嬷疄椴∫?，足暴青，胸若將裂，腸若將以刀切之，煩而不能食?！边@些描述與急性腹膜炎的癥狀相似，提示在急性腹膜炎的某階段，可參照其中的理法方藥進行辨治。

急性腹膜炎中醫辨證多為陽明證或少陽陽明合病，病位在腑，常表現出腹滿拒按、便結或便閉等熱結陰陽、腑實不通之證。根據中醫“腑通以通為補，六腑以通為用”的原則，治療以清熱解毒、通里攻下為主，活血化瘀、理氣開郁為輔。通腑攻下具有泄熱、行瘀、通便的作用，可促進腸蠕動，改善腹腔及臟器的血液循環，促進炎癥的局限和吸收，同時減少了內毒素異位，從而顯著減輕腸源性內毒素血癥造成的臟器損傷[10]。川黃合劑取大黃和川芎配伍，能“通里攻下、清瘀熱、解熱毒”，同時“氣行則血行”?，F代醫學研究發現大黃有改善微循環、抑酶、抑菌、抑制巨噬細胞過度激活及中性粒細胞浸潤，減少炎癥細胞因子及自由基的釋放等作用[11]。大黃還可抑制炎癥因子表達；增加腸蠕動，減少腸道對葡萄糖、鈉、水的吸收稀釋和排泄細菌和毒素；保護腸道黏膜屏障，阻止腸道細菌易位和內毒素血癥的發生；抑制腸道細菌生長，達到清理腸道的作用；腸外器官保護作用。川芎具有改善微循環的作用，并且可以提高其他藥物的抗炎作用[12]。李繼承等[13]研究發現中藥川芎的主要藥理成分川芎嗪具有明顯的抗菌和促進巨噬細胞吞噬功能的作用。賈米山等[14]用川芎嗪治療結核性腹膜炎，結果顯示可使腹水滲出減少，促進腹水吸收，使腸粘連迅速緩解，明顯控制患者結核中毒癥狀，縮短病程。

本研究結果顯示，TNF-α能顯著上調HPMCs IL-6和IL-8的表達，且抑制細胞活性，而川黃合劑能顯著對抗TNF-α的上述作用，提示川黃合劑確有抑制炎癥因子IL-6和IL-8表達、保護腹膜細胞的作用。

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Effect of Chuan-huang mixtures on TNF-α-induced IL-6 and IL-8 expressions in human peritoneal mesothelial cells in vitro

ZHU Guisong, FU Yuandong, CHEN Changquan

(Nanjing Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210001,Jiangsu,China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of Chuan-huang mixtures on TNF-α-induced IL-6 and IL-8 expressions and proliferation in human peritoneal mesothelial cells (HPMCs) in vitro. Methods Cell lines of HPMCs were subcultured and all experiments were performed using the cells at the third passage. After synchronization of cells growth with RPMI-1640 culture solution containing 1% fetal bovine serum, HPMCs were divided into blank control group, TNF-α-induced (1 μg/L) group and TNF-α-induced plus low-, medium-and high-dose Chuan-huang mixtures groups. The proliferation of HPMCs was measured by MTT and flow cytometry assay. Proteins of IL-6 and IL-8 in culture supernatants were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Cell protein concentration was measured by trace bicinchoninic acid (BCA) method to correct the ELISA assay results. Results After co-culturing by 48h, the proliferation of HPMCs in TNF-α-induced plus low-, medium-and high-dose Chuan-huang mixtures groups were significantly increased compared to TNF-α-induced group (all P<0.05). Moreover, Chuan-huang mixtures could significantly decrease TNF-α-induced IL-6 and IL-8 expressions in protein levels (all P<0.05). Conclusion Chuan-huang mixtures dose not only promote the cells proliferation, but also inhibit expressions of IL-6 and IL-8 in HPMCs cultured under inflammatory conditions.

Key words:Chuan-huang mixtures; Rhubarb; Ligustrazine; Interleukin-6; Interleukin-8; acute peritonitis

[收稿日期]2015-11-25

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)11-1169-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.11.008

[基金項目]南京市醫學科技發展項目(YKK14144)

[作者簡介]朱桂松，男，主治醫師，博士，主要從事危重病的基礎和臨床研究。