肝內膽管細胞癌相關成纖維細胞的分離、純化及鑒定

楊柳曉， 高　強

1.復旦大學附屬中山醫院重癥醫學科, 上海　200032 2.復旦大學附屬中山醫院肝外科, 上海　200032

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·論著·

肝內膽管細胞癌相關成纖維細胞的分離、純化及鑒定

楊柳曉1， 高強2*

1.復旦大學附屬中山醫院重癥醫學科, 上海200032 2.復旦大學附屬中山醫院肝外科, 上海200032

[摘要]目的： 探討肝內膽管癌相關成纖維細胞(iCAFs)的分離、純化和鑒定方法，為后續研究奠定基礎。方法： 在無菌條件下，留取肝內膽管細胞癌(iCCA)組織標本，充分剪碎后置入含Ⅳ型膠原酶和透明質酸酶的消化液中恒溫振蕩，將所得的單細胞懸液進行免疫磁珠分選純化，分離出腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)并培養。通過觀察細胞形態，并經免疫熒光和流式細胞儀測定，鑒定其是否為iCAFs。結果： iCAFs呈長條形或紡錘形，胞質透明，折光明顯，胞核單個、呈圓形或卵圓形, 細胞突起相互交錯重疊形成網格狀排列、密集時呈現 “峰-谷”樣表現；免疫熒光檢測顯示，α平滑肌肌動蛋白(+)、波形蛋白(+)、復合型角蛋白抗體(-)；流式細胞儀檢測示，α平滑肌肌動蛋白(+)，同時CD34和CD45均為(-)。結論： 酶消化法聯合免疫磁珠分選可有效分離出高純度的iCAFs，為進一步研究iCAFs的相關功能研究提供了良好的平臺。

[關鍵詞]肝內膽管細胞癌；腫瘤相關成纖維細胞；分離；鑒定

腫瘤微環境中的成纖維細胞被活化后可以通過自分泌和(或)旁分泌途徑為上皮提供促癌信號、參與腫瘤血管的形成，促進腫瘤侵襲轉移[1]。這類具有特殊表型及功能、存在于腫瘤間質中的成纖維細胞群即被稱為腫瘤相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)。研究[2]證實，CAFs的聚集和活化可以影響多種實體腫瘤的發生、發展及侵襲。肝內膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)是一種具有豐富間質成分的原發性肝癌，其腫瘤間質中富含的CAFs與肝內膽管細胞癌的發生發展密切相關[3]。為能進一步研究iCCA相關成纖維細胞(iCAFS)的生物學特性和影響腫瘤的機制，原代iCAFs的分離純化和培養擴增是必要的。目前國內外對CAFs的分離主要采用組織塊貼壁法和酶消化法。本研究采用酶消化法聯合免疫磁珠分選進行原代iCAFs的分離、純化及培養，證實具有可重復性及高純度獲得iCAFs的優勢，有助于后續實驗的進行，現報告如下。

1材料與方法

1.1主要儀器及試劑Ⅳ型膠原酶購自美國Invitrogen公司、透明質酸酶和牛血清蛋白(BSA)購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養液、0.25%胰蛋白酶、雙抗(青霉素、鏈霉素100 mg/L)、1×磷酸鹽緩沖液(PBS)等購自美國Gibco公司；免疫組化及免疫熒光抗體α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)、復合型角蛋白抗體(pan-CK)購自英國Abcam公司，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和二抗購自上海碧云天生物技術有限公司；流式細胞實驗用α-SMA-FITC、CD34-PE和CD45-APC抗體購自美國R&D公司；免疫磁珠分選儀及anti-fibroblast MicroBeads試劑盒(130050601)購自德國美天旎生物技術有限公司。

1.2標本來源及采集用于原代分離的腫瘤標本來自iCCA根治性切除的患者。在標本手術切除離體后15 min內，用無菌手術刀片切取體積大于1 cm3的組織塊，盡量選取活性好、典型的腫瘤區域，避開壞死、出血區域及血管，置于含DMEM+1%雙抗的50 mL離心管內，于4℃條件轉移至實驗室。

1.3細胞分離及純化

1.3.1細胞酶消化法分離在超凈臺中，用含有雙抗的PBS液反復漂洗癌組織標本多次，以去除血細胞；待沖洗液清亮后，用眼科剪修剪掉其他組織及肉眼可見的血管結構；用無菌手術刀片及眼科剪機械法將組織塊盡量剪碎至<1 mm3，置于預先配制好的消化液(DMEM+0.1%BSA+1%雙抗+500 U/mL Ⅳ型膠原酶+100 U/mL透明質酸酶，用0.22 μm孔徑一次性無菌抽濾器過濾除菌)中，注意將組織完全浸沒，于37℃恒溫振蕩儀內振蕩30 min(200 次/min)。消化后經過400目篩網過濾，將濾液離心(800×g, 5 min)以分離上皮細胞和成纖維細胞,棄去沉淀的細胞團，將含有成纖維細胞的上清懸液再離心(100×g，10 min)，得到的沉淀細胞團用DMEM反復漂洗2～3次，重懸再離心(300×g，10 min)后進行免疫磁珠分選。

1.3.2細胞免疫磁珠分選純化將分離所得細胞計數后,以每107個重懸于80 μL分選緩沖液中，加入20 μL的anti-fibroblast磁珠抗體,充分混合后避光置于室溫(19～25℃)孵化30 min。用1～2 mL的分選緩沖液重懸后再離心(300×g，10 min)，所得細胞團重懸于500 μL的分選緩沖液中，按照免疫磁珠分選說明書，使用免疫磁珠分選器及LS柱進行陽性細胞的分選純化。純化后的細胞用培養液(DMEM+10%FBS+1%雙抗)重懸后置于25 mL培養瓶，常規培養、傳代。

1.4細胞鑒定

1.4.1形態學觀察使用倒置相差顯微鏡每日觀察細胞的貼壁情況，貼壁后的生長狀況及形態變化。

1.4.2免疫熒光檢測將已消毒的24 mm×24 mm蓋玻片置于細胞培養六孔板的培養孔中，按1×105個/mL的細胞密度將細胞接種于培養孔中進行細胞爬片，2 d后進行免疫熒光鑒定。除去培養液，用PBS(1 mL/孔)漂洗3次(每次5 min)；加入1 mL 4%多聚甲醛(用PBS配制)，室溫固定30 min，PBS洗3次(每次5 min)；加入0.5% TritonX-100(用PBS配制)室溫孵育20 min，PBS洗3次(每次5 min)；加入5%山羊血清室溫封閉30 min，去除血清，加一抗(α-SMA、vimentin、pan-CK)，4℃過夜，PBS洗3次(每次5 min)；加熒光二抗(1∶1 000)室溫反應30 min，PBS洗3次(每次5 min)；DIPA染核，加熒光封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.4.3流式細胞儀檢測將分離培養的細胞制備成1×106個/mL的懸液，加入1 mL破膜固定液于4℃遮光孵育30～60 min，離心重懸，經BSA封閉后加入流式抗體(α-SMA-FITC、CD34-PE、CD45-APC及同型對照)混勻，于4℃冰箱孵育20～30 min后，混勻離心棄上清，重懸后上機檢測。

2結果

2.1細胞形態及傳代將分離的細胞接種于25 mL培養瓶1～2 h后即可見貼壁，初始貼壁細胞常為圓形；24～48 h后逐漸伸展成長條形，胞膜同時形成多個大小不一的突起，胞質透明，折光明顯，胞核單個、呈圓形或卵圓形(圖1A)；此后這些突起不斷向周邊延伸擴展，并相互交錯重疊形成網格狀排列(圖1B)；當細胞鋪滿培養瓶時，顯微鏡下呈現典型的“峰-谷”樣表現(圖1C)。初代培養需每2～3 d更換培養液，通常經過1周左右即可傳代；第3代以后細胞增殖迅速，3～4 d即可傳代。細胞所能傳的代數受供體個體差異影響較大。

圖1　顯微鏡下iCAFs的形態A：生長第2天的iCAFs(100×)；B： 生長第10天的iCAFs (100×)；C：生長第10天的iCAFs (40×)

2.2細胞免疫熒光染色特點將分離的細胞進行免疫熒光染色，由圖2可見，細胞形態如前所述，pan-CK染色陰性，排除其上皮來源的可能性；而α-SMA和vimentin染色強陽性，高倍鏡下可見細胞質內條索狀纖維組織染色均勻，胞核清晰完整。Vimentin染色陽性通常提示細胞來源于間葉組織，而α-SMA是CAFs的特征性標志物。

2.3流式細胞儀鑒定結果用流式細胞儀檢測分離培養的細胞α-SMA、 CD34、 CD45的表達情況。細胞主要表現為α-SMA(+)、同時CD34(-)和CD45(-)的特征。以同型對照為參照，α-SMA陽性表達的細胞達99.1%，提示其成纖維細胞的特征；而CD34和CD45基本不表達，證明其不是來源于內皮和(或)髓源性細胞系(圖3)。

圖2　iCAFs免疫熒光染色的結果

圖3　iCAFs流式細胞檢測結果A：設門圈定檢測的iCAFs細胞，FSC為前向角度散射，SSC為側向角散射；B：iCAFs表現為α-SMA(+)CD45(-)；C：iCAFs表現為α-SMA(+)CD34(-)

3討論

3.1CAFs分離純化的方法CAFs是腫瘤微環境重要的組成成分之一，其與腫瘤細胞之間的相互作用可以影響腫瘤的發生、發展及預后。一般認為，CAFs具有促進腫瘤生長、侵襲及轉移的能力[2]。但由于其來源及構成的多樣性，目前也有研究者認為其功能存在異質性，甚至具有抑制腫瘤的作用[4-6]。而針對iCAFs的研究也正從功能研究深入至iCCA靶點治療等方面[7]。為進一步了解iCAFs影響腫瘤的作用機制，原代iCAFs的分離純化和培養擴增是必要的。

目前，常見的CAFs的原代分離方法有組織塊貼壁法和酶消化法。組織塊貼壁法是將腫瘤組織剪碎成小塊狀，貼于培養瓶或培養皿壁上，加入適量培養基，待細胞從組織塊邊緣慢慢爬出。此方法簡便易行，無需特殊的試劑和材料，便于推廣。但也存在如下缺點[8]：(1)周期長，細胞從組織塊邊緣爬出一般需要10～15 d，同時剛爬出的細胞擴增能力差，3～4周左右才能長滿瓶底；(2)純度差，在細胞爬出過程中，會摻雜有其他種類細胞；(3)效率低，成功率僅約60%。

酶消化法是將腫瘤組織碾碎后，添加各種消化酶，經過振蕩消化，將細胞從組織中分離出來形成單細胞懸液，再進行過濾、離心、接種的方法。此方法相較于組織塊貼壁法具有周期短、重復性強、效率高等優勢。目前使用較多的消化酶包括胰蛋白酶和膠原酶。胰蛋白酶適于消化細胞間質較少的組織，對于iCCA這類組織內間質豐富的腫瘤，胰蛋白酶的消化效率則大大下降。本研究借鑒Mazzocca等[9]分離肝細胞肝癌相關成纖維細胞的經驗，采用Ⅳ型膠原酶、透明質酸酶及BSA制備的消化液,對細胞恒溫震蕩消化，可以快速從腫瘤組織中分離出大量單細胞，且能更大程度保證細胞的活性。

在體外培養原代細胞時，通常需要實驗的一致性和可重復性，這樣才能保證這一細胞生物學特性研究結果的可靠性，因而細胞的純化就成為原代細胞分離培養中關鍵的一步。無論是組織貼壁法還是酶消化法，所得的原代細胞中通常混雜有其他類型的細胞，因此在后續的培養傳代中還需要通過自然純化法、時間差酶消化法、機械刮除或反復貼壁等方法來進一步純化[10]。這些方法大多需要經過多次傳代，而代次的增加會影響原代細胞的生物學特性。本研究將酶消化法所得的單細胞懸液通過梯度離心去除大部分上皮細胞后，再進行免疫磁珠分選，用anti-fibroblast的磁珠抗體和LS柱陽性分選CAFs，所得細胞經流式細胞儀檢測，顯示其純度達99.1%。免疫磁珠分選可以迅速純化細胞，縮短整個原代細胞分離培養的時間，其缺點為：免疫磁珠抗體費用昂貴，且分選過程可能造成部分原代細胞的裂解或活力下降。

3.2iCAFs分離培養的關鍵問題原代iCAFs在分離培養過程中除需要注意無菌等原代細胞的分離培養的一般問題外，還要注意以下幾個關鍵問題。(1)腫瘤組織的取材和運輸：在腫瘤組織標本離體后應即刻取材，以免細胞的活性降低；切取的組織于冰上運輸以保證組織新鮮。(2)組織塊的剪切：所取的腫瘤組織盡量剪碎成肉糜狀，以利于組織表面與消化液充分接觸，縮短消化時間。(3)選擇合適的消化酶：以往的報道顯示乳腺癌、口腔癌等CAFs的原代分離通常用胰蛋白酶或Ⅰ型膠原酶[11-12]，但iCCA較這些腫瘤含有更多的間質成分。因此，本研究配置了含DMEM、0.1%BSA、1%雙抗、500 U/mL Ⅳ型膠原酶、100 U/mL透明質酸酶的消化液。其中Ⅳ型膠原酶包含至少7種蛋白酶，可以消化多種組織；透明質酸酶可以降低細胞間質的黏性，利于單個細胞的析出；而BSA可以提高細胞消化過程中所需的營養。(4)恰當的消化時間：不同的腫瘤組織在不同的消化液濃度下所需要的消化時間也不同。本研究早期根據國外研究[8]的經驗消化16 h，發現細胞均死亡，無法貼壁生長。而消化時間太短又無法獲得足夠量的單細胞。通過不斷摸索，本研究確定于37℃恒溫箱內以200 次/min持續震蕩消化30～45 min基本可以獲得滿意的單細胞懸液。具體的消化時間根據需消化的組織量來決定。(5)免疫磁珠分選時注意動作輕柔，以避免細胞因發生機械性擠壓而破裂、死亡。

綜上所述，采用Ⅳ型膠原酶加透明質酸酶消化法聯合免疫磁珠分選原代iCAFs，具有可重復性及高純度獲得的優勢，為后續實驗提供了良好的平臺。

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[本文編輯]姬靜芳

Isolation, purification, and identification of intrahepatic cholangiocarcinoma associated fibroblasts

YANG Liu-xiao1, GAO Qiang2*

1.Department of Intensive Care Unit, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2.Department of Hepatic Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

[Abstract]Objective： To explore the methods of isolation, purification, and identification of intrahepatic cholangiocarcinoma (iCCA) associated fibroblasts (iCAFs), which could facilitate further functional and pharmacological evaluation.Methods： Under aseptic conditions the tissue specimens of iCCA were obtained, minced, and digested in the digestive medium supplemented with collagenase Ⅳ and hyaluronidase. The single-cell suspension underwent immunomagnetic separation and purification, and carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) were separated and cultured. Through morphological observation, immunofluorescent staining and flow cytometry analysis, whether the cells were iCAFs or not.Results： Morphologically, iCAFs were elongated or fusiform, with transparent cytoplasm, obvious refraction, single round or ovoid nucleus. Cellular processes overlap to form grids and show the "peak-valley" pattern. Under immunofluorescence, the typical iCAFs showed positive staining for alpha smooth muscle actin (α-SMA) and vimentin, and negative staining for pan-cytokeratin. Under flow cytometry detection, they were positive for α-SMA and negative for both CD34 and CD45.Conclusions： Enzyme digestion in combination with immunomagnetic separation can effectively separate iCAFs with high purity, providing a good platform for further studies on the roles of iCAFs in the pathogenesis of iCCA.

[Key Words]intrahepatic cholangiocarcinoma; carcinoma-associated fibroblasts; isolation; identification

[中圖分類號]R 735.9

[文獻標志碼]A

[作者簡介]楊柳曉，博士，主治醫師. E-mail: yang.liuxiao@zs-hospital.sh.cn*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: gao.qiang@zs-hospital.sh.cn

[基金項目]國家自然科學基金(81372648, 81502028). Supported by National Natural Science Foundation of China(81372648, 81502028).

[收稿日期]2016-01-22[接受日期]2016-02-25