生物素-親和素橋接系統在骨組織工程中的應用

馮自豪， 李　偉， 劉家祺， 亓發芝

復旦大學附屬中山醫院整形外科， 上海　200032

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·論著·

生物素-親和素橋接系統在骨組織工程中的應用

馮自豪， 李偉， 劉家祺， 亓發芝*

復旦大學附屬中山醫院整形外科， 上海200032

[摘要]目的： 觀察生物素-親和素橋接系統(avidin-biotin binding system，ABBS)對骨組織工程中種子細胞與支架材料黏附的影響，探討ABBS在骨組織工程的作用。方法： 以脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)作為種子細胞、β磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate，β-TCP)作為支架材料建立組織工程骨模型。實驗分為兩組，對照組：ADSCs與多孔β-TCP支架復合物結合；實驗組：ABBS修飾的ADSCs與多孔β-TCP支架復合物結合。通過免疫熒光以及流式細胞儀檢測ADSCs生物素化的效率。計算并比較兩組的細胞黏附率；在掃描電鏡下觀察 ADSCs與多孔β-TCP支架黏附的表面情況。結果： 生物素化的ADSCs熒光染色顯示生物素結合部位在細胞胞質，且流式細胞儀檢測提示生物素化細胞陽性率為95%。ADSCs與多孔β-TCP支架復合物結合10 min、30 min、60 min、12 h、24 h時，對照組和實驗組的細胞黏附率分別為(2.31±0.14)%和(21.75±4.69)%、 (11.96±2.53)%和(54.82±12.37)%、(33.48±9.51)%和(78.69±15.65)%、 (78.29±10.63)%和(95.46±7.38)%、(94.79±10.42)%和(98.13±1.45)%。生物素化的 ADSCs 與親和素化多孔β-TCP 支架材料的黏附效果在10 min、30 min、60 min、12 h 4個時間點明顯高于未修飾的 ADSCs 與多孔β-TCP 支架的黏附效果(P<0.05)。電鏡下觀察，ABBS組與對照組無明顯差別。結論： ABBS可以促進ADSCs在支架上早期黏附，有利于細胞增殖，并且對組織工程骨的生物相容性無明顯影響。

[關鍵詞]骨組織工程；生物素-親和素橋接系統； 脂肪來源干細胞；β-磷酸三鈣支架

較大的骨缺損一直是修復重建領域的難題。20世紀80年代，骨組織工程概念的提出為解決這一臨床問題提供了新的思路和方法。種子細胞與生物支架結合構建的組織工程骨可以促進骨修復，而兩者的緊密黏附是細胞間信息傳遞的基礎，對細胞的增殖、表型的表達、細胞外基質的合成具有重要作用。因此，這也成為構建組織工程骨的首要關鍵步驟。近年來發展迅速的生物素-親和素橋接系統(avidin-biotin binding system，ABBS)已廣泛應用于分子生物學研究中，生物素和親和素的非共價鍵結合使ABBS成為目前已知最強的一種結合粘連系統[1]。據此，本研究以脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)作為種子細胞[2]、β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate，β-TCP)作為支架材料[3]建立組織工程骨模型，以ABBS修飾ADSCs，探討ABBS對細胞黏附于生物支架的促進作用。

1材料與方法

1.1實驗儀器及試劑恒溫加熱器(上海實驗儀器廠有限公司)，CKX41光學顯微鏡、倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，NOVA 掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)，熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)，CS-101 電熱干燥箱(重慶試驗儀器設備廠)，低溫離心機(德國Eppendorf公司)，電子精密天平(型號：FA2004，上海精密科學儀器有限公司)，垂直層流潔凈工作臺(型號：CA-1390-1，上海上凈凈華設備有限公司)。0.25%胰酶-0.02%EDTA(上海試劑公司)，PBS、DMEM、FBS(美國Gibco公司)，地塞米松、抗壞血酸、吲哚美辛、L-谷氨酰胺、DMSO均購自美國Sigma公司，生物素、親和素均購自美國Pierce公司。

1.2實驗材料及動物新西蘭大白兔1只(由復旦大學醫學院實驗動物科學部提供)，雄性，6個月齡，體質量 2.5 kg 。取新西蘭大白兔雙側腹股溝處脂肪組織，提取兔ADSCs。將納米級多孔β-TCP支架材料制備成5 mm×5 mm×4 mm大小，置于24孔板中備用。

1.3實驗方法

1.3.1ADSCs的生物素化處理將ADSCs置于 CO2培養箱中培養，吸除培養基并用PBS洗滌貼壁細胞2次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 混合消化液 1～1.5 mL，吸去消化液，立即用含10%FBS的DMEM-F12(1∶1)完全培養基終止消化。將細胞懸液收集到離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，按1∶4進行傳代培養，吸去瓶內殘留培養液，用37℃的PBS清洗 2 次后，吸去殘余液體，加入已臨時配制好的生物素(3-Sulfo-NHS-Biotin)溶液(0.5 mg/mL)2 mL，輕輕搖晃后將培養瓶置于 CO2培養箱中孵育30 min。

1.3.2β-TCP支架材料的親和素化處理將支架材料浸于 75%乙醇中過夜，取出后用 PBS 反復沖洗 3 次，晾干備用。將材料分為兩組，實驗組：支架材料浸于配制好的親和素溶液(2 mg/mL)中，并于常溫下孵育 2 h；對照組：支架材料浸于PBS中常溫下孵育 2 h。孵育結束后，用 PBS 清洗 3～5 min，無菌保存備用。

1.3.3細胞黏附試驗實驗組：生物素化 ADSCs加親和素化β-TCP 支架；對照組： ADSCs加β-TCP 支架。將2 mL密度為 1×106/mL 的ADSCs細胞懸液種植于支架材料表面， 并充分搖勻；從將細胞懸液加入材料表面開始計時，分別在10 min、30 min、1 h、12 h和 24 h，取出支架材料，于 2 mL PBS 中輕輕漂洗,去除表面未黏附的細胞， 用 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 混合消化液2 mL消化表面黏附的細胞。

1.4觀察指標和檢測指標

1.4.1ADSCs生物素化鑒定將未經生物素化處理的細胞作為對照。將生物素處理的細胞及對照組未處理細胞分別用 37℃ PBS輕輕清洗2遍，然后用 4%多聚甲醛固定 30 min，PBS 清洗 3～5 min，再用 avidin-FITC (1∶64)常溫下孵育 5 min，然后 PBS 清洗 3～5 min，最后用 DAPI (5 μg/mL)復染細胞核，室溫下孵育20 min，孵育結束后，用 PBS 清洗3～5 min。最后用封片液封片，立即于異硫氰酸熒光素(FITC)熒光顯微鏡下觀察綠色熒光分布情況，并用流式細胞儀檢測生物素化陽性率。

1.4.2細胞黏附率檢測用細胞計數板計數PBS與混合消化液中的細胞，計算10 min、30 min、1 h、12 h和24 h的細胞黏附率。每組每個時間點各取3個標本檢測。

1.4.3細胞-支架材料復合物相容性觀察培養第1、4、7天肉眼觀察實驗組與對照組細胞-支架材料復合物的顏色、形狀、表面情況。并于掃描電鏡下觀察，觀察種子細胞在支架材料上的聚集、附著及生長情況。

2結果

2.1ADSCs的生物素化鑒定經生物素化處理的ADSCs用avidin-FITC(1∶64)常溫下孵育 5 min后，在熒光顯微鏡下觀察發現細胞呈綠色，顯示 ADSCs 細胞生物素化(圖1A)。經流式細胞儀檢測， ADSCs 細胞生物素化陽性率為 95%(見圖1B)。

圖1　ADSCs 的生物素化鑒定A:ADSCs生物素化處理后經 avidin-FITC 免疫熒光染色(×500)； B： ADSCs 生物素化處理后經流式細胞儀檢測， 灰色峰代表100%陽性對照，而紅色峰代表ADSC生物素化鑒定的結果

2.2ADSCs與β-TCP以及 ABBS修飾后ADSCs與β-TCP 在不同時間點的黏附率將ADSCs細胞懸液種植于支架材料表面10 min、30 min、60 min、12 h、24 h時，對照組和實驗組的黏附率分別為 (2.31±0.14)%和(21.75±4.69)%、(11.96±2.53)%和(54.82±12.37)%、(33.48±9.51)%和(78.69±15.65)%、(78.29±10.63)%和(95.46±7.38)%、(94.79±10.42)%和(98.13±1.45)%，前 4 個時間點兩組間差異均有統計學意義(P<0.05)，24 h時兩組差異無統計學意義，見圖2。

2.3細胞-支架材料復合物的觀察剛接種兔ADSCs 的細胞-支架材料復合物呈粉紅色，表面濕潤。培養第 1、 4、 7 天，復合物顏色無明顯變化，組間無明顯差異。

細胞-支架材料復合物的掃描電鏡觀察：兔ADSCs接種多孔β-TCP 支架材料第1天，表面可見細胞附著，呈簇狀聚集，順應材料粗糙表面，未向周圍伸展，支架材料孔隙內尚未見細胞生長；接種第4天，可見細胞緊密貼附于材料表面，孔隙內可見細胞生長；第7天，細胞充分伸展，相互連接，孔隙內觀察到細胞生長，并可見部分細胞外有形成分填充支架材料的小孔，提示細胞外基質的產生(圖3A、3B)。 電鏡下觀察顯示，ABBS修飾后的ADSCs與β-TCP支架材料復合物與未經修飾的細胞-支架材料復合物無明顯差別(圖3 C、3D)。

圖2　ADSCs 與β-TCP 以及 ABBS 修飾后 ADSCs 與β-TCP 在不同時間點的黏附率測定　　*P<0.05與β-TCP相比；n=3，±s

圖3　掃描電鏡下觀察ADSCs或ABBS 修飾后的ADSCs接種于β-TCP 支架材料復合物掃描電鏡下觀察A:ADSCs 與β-TCP 共培養 7 d(×1 000)；B:ADSCs 與β-TCP共培養 7 d(×1 200)；C: ABBS 修飾后 ADSCs 與β-TCP 共培養 7 d(×1 000)；D: ABBS 修飾后 ADSCs 與β-TCP 共培養 7 d(×1 200)

3討論

骨組織工程的關鍵步驟是種子細胞在支架上的黏附，直接將細胞懸液滴加到支架材料上是其常用的方法。盡管這種方式簡便易行并已沿用多年，但存在細胞接種效率低、細胞分布不均勻的問題，導致組織工程骨質量下降，嚴重影響修復效果。提高種子細胞和支架之間的黏附力已經成為當前骨組織工程學迫切需要解決的問題。

有學者期望通過模仿生理情況下的細胞黏附機制，提高骨組織工程中種子細胞和支架的黏附能力。整合素是一類位于細胞表面的黏附性受體分子，屬于異二聚體跨膜糖蛋白家族之一，是介導細胞與細胞外基質及細胞與細胞之間黏附的主要細胞表面受體。Jeschke等[4]通過應用整合素提高黏附能力來增加細胞結合的效率。在正常組織中，細胞和細胞外基質的黏附是通過細胞膜上的受體和細胞外基質中的纖連蛋白結合而完成的，已有學者將經纖連蛋白預處理的支架應用于組織工程研究[5]。

ABBS是近年來發展迅速的一門生物學技術[6-7]。生物素廣泛分布于動、植物組織中，以卵黃和肝組織中含量較高，相對分子質量為244.31。親和素又稱抗生物素或卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的堿性糖蛋白。此外，阿維丁鏈霉菌(Streptomycesavidini， ATCC編號：27 419 )在生長過程中可分泌產生鏈霉親和素(Streptavidin,SA)。親和素相對分子質量為 68 000, 等電點(pI)為10.5，耐熱，并耐受多種蛋白水解酶的作用。ABBS具有高靈敏度、高特異性、高穩定性和適用性。生物素易與蛋白質和核酸類等生物大分子結合，形成生物素衍生物，不僅能保持大分子物質的原有生物活性，并且具有多價性[8]。親和素與生物素間的結合具有極高的親和力，其反應呈高度特異性，不增加非特異性干擾，也不會因反應試劑濃度的不同而受影響。酸、堿、變性劑及有機溶劑均不會影響親和素與生物素的結合力。ABBS的橋接作用： 生物素和親和素都可偶聯蛋白質、核酸、多糖和酶等各類生物活性物質，而且同時能與物理材料相結合。因此，有學者將 ABBS 技術應用于偶聯內皮細胞和人工血管支架材料，內皮細胞的黏附率顯著增高，在支架上所綁定的細胞數提高了 7.5 倍[9]。另有學者將 ABBS 技術用于黏合肝臟細胞和支架材料，發現肝臟細胞在10 min內便能夠與生物支架材料結合，而且 ABBS 對肝細胞的分泌功能和跨膜信號的傳遞能力無影響[10]。

近年來，ABBS用于改善種子細胞在支架材料的黏附已有相關的報道。 ABBS 是一種不同于粘連蛋白-受體系統的新型粘連系統,是目前已知的最強的非共價鍵結合方式之一。一個親和素分子可以與4個生物素分子結合,其親和力可達1015M-1, 而粘連蛋白-受體系統的親和力僅為 106M-1。Kuo等[11]將ABBS應用于組織工程，發現其可使種子細胞在支架材料表面的黏附力提高至少 2～3 倍。ABBS 的另一優點是結合速度非常快。國外有研究[12]報道，1 h內可有超過 70%的生物素化種子細胞黏附于親和素處理過的材料表面，而僅有32%的未生物素化的種子細胞黏附于未經處理的材料表面。另有研究[13]報道，ABBS 在 10 min內即可顯著促進種子細胞牢固地黏附于支架材料表面。關于利用 ABBS 系統是否能夠有效促進 ADSCs 在多孔β-TCP 支架材料上的黏附，目前尚未見文獻報道。

本實驗采用 ABBS 接種方式使ADSCs與多孔β-TCP支架黏附，結果發現10 min、30 min、1 h、12 h和24 h對照組與實驗組的黏附率分別為(2.31±0.14)%和(21.75±4.69)%、 (11.96±2.53)%和(54.82±12.37)%、 (33.48±9.51)%和(78.69±15.65)%、 (78.29±10.63)%和(95.46±7.38)%, (94.79±10.42)%和(98.13±1.45)%，前 4個時間點兩組間有顯著差異，24 h時兩組差異無統計學意義，說明生物素化的 ADSCs 與親和素修飾的β-TCP 支架材料間的細胞黏附效果在早期(12 h以內)明顯優于未修飾的 ADSCs 和多孔β-TCP 支架。因此生物素-親和素系統可以促進 ADSCs 在支架上的早期黏附，有利于細胞增殖。但 24 h 兩組細胞黏附率無顯著差異， 說明ABBS 僅有促進早期黏附的功能；而晚期兩組黏附率差異性不大，可能與細胞的總量相關，在黏附后期，未黏附的細胞越來越少，兩組間差異也因此越來越不明顯。

在生物相容性實驗中對細胞-支架材料復合物進行掃描電鏡觀察之前，需要對樣品進行處理，其中用到臨界點干燥法也即在無氣液界面、無表面張力的臨界狀態下干燥細胞-支架材料復合物。因為不存在表面張力，所以不會引起細胞皺縮和變形，能夠較好地保存樣品的超微結構。操作中，以醋酸異戊酯作為脫水劑和置換劑，壓力接近 1.013 2×107Pa(100 個大氣壓)，否則容易導致實驗失敗。

無論是三維的多孔支架材料還是傳統的二維材料，最先與組織細胞發生接觸的是材料表面。因此細胞材料表面的黏附性非常重要，影響細胞的增殖、分化等生物學行為。通過掃描電鏡的觀察可以看出，兔 ADSCs 可以在納米級多孔β-TCP 支架材料的表面附著，隨著時間推移，可以向孔隙內生長，并在第7天分泌細胞外基質，證明支架材料與細胞的相容性好。一般情況下，細胞沿著材料表面的突起部分或紋理進行取向和遷移，這一現象稱為接觸誘導。細胞取向的程度取決于表面溝槽的深度與寬度，且與細胞種類有很大關系。實驗中發現，細胞呈長梭狀伸展，但材料表面形態為隨機的凹凸相間的粗糙結構，這種細胞形態可能是由兔ADSCs本身的特性和材料特征共同決定的。

骨組織缺損是臨床上常見的病癥，而組織工程骨的構建對其治療有重大意義。如何促進種子細胞與支架材料之間的黏附、結合成為目前相關研究的一大熱點。我們的實驗證實，ABBS可以促進ADSCs在支架上的早期黏附，有利于細胞增殖，并且對組織工程骨的生物相容性無明顯影響。盡管目前仍有大量工作需要完成，仍有諸多問題需要探討，但隨著干細胞理論、材料學、細胞生物學的發展，隨著組織工程學治療策略的提出和不斷完善，ABBS在組織工程及臨床修復重建領域的應用將有廣闊的研究前景。

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[本文編輯]姬靜芳

Application of avidin-biotin binding system in bone tissue engineering

FENG Zi-hao, LI Wei, LIU Jia-qi, QI Fa-zhi*

Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

[Abstract]Objective： To observe the effect of avidin-biotin binding system(ABBS) to the adhesion between seed cells and scaffolds in bone tissue engineering, and investigate the role of ABBS in bone tissue engineering. Methods： We used adipose-derived stem cells (ADSCs) as seed cells and β-tricalcium phosphate (β-TCP) as scaffolds to establish tissue engineering bone, which was modified by ABBS. We used immunofluorescence and flow cytometry to test the efficiency of biotinylated ADSCs. The materials were divided into ABBS group (ADSCs and β-TCP modified by ABBS) and control group, and we tested the adhesion efficiency of both groups. We used scanning electron microscopy to detect the biocompatibility of ADSCs with the porous β-TCP scaffolds (control group) and the ABBS-modified porous β-TCP scaffolds (experimental group). Results： Biotinylated ADSCs staining showed that the biotin binding sites were in the cell cytoplasm, and flow cytometry showed that the rate of biotinylated positive cells was 95%. At different time points (10 min, 30 min, 60 min, 12 h, 24 h), the adhesion rates of control group vs ABBS group were (2.31±0.14)% vs (21.75±4.69)%, (11.96±2.53)% vs (54.82±12.37)%, (33.48±9.51)% vs (78.69±15.65)%, (78.29±10.63)% vs (95.46±7.38)%, and (94.79±10.42)% vs (98.13±1.45)%, respectively. The adhesion rate of the ABBS group during the early stages (10 min, 30 min, 60 min, 12 h) were much higher. There was no much difference between the two groups under scanning electron microscopy. Conclusions： ABBS can promote the adhesion of ADSCs on scaffolds during the early stage, which is good for cell proliferation, and has no obvious effect on the biocompatibility of tissue engineered bone.

[Key Words]bone tissue engineering; avidin-biotin binding system; adipose-derived stem cells; β-tricalcium phosphate scaffolds

[中圖分類號]R 681

[文獻標志碼]A

[作者簡介]馮自豪，主治醫師. E-mail: feng.zihao@zs-hospital.sh.cn*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990-2575, E-mail: qi.fazhi@zs-hospital.sh.cn

[收稿日期]2015-12-12[接受日期]2016-03-10