Smad1參與調節雌激素在乳腺癌細胞中的促增殖作用

王　景， 張鶴達， 李　建， 趙建華， 吳建中， 唐金海

南京醫科大學第四臨床醫學院，南京　210029

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·論著·

Smad1參與調節雌激素在乳腺癌細胞中的促增殖作用

王景， 張鶴達， 李建， 趙建華， 吳建中， 唐金海*

南京醫科大學第四臨床醫學院，南京210029

[摘要]目的： 觀察在雌激素促進乳腺癌發生、發展的過程中，Smad1與雌激素的相互作用關系，以及其對乳腺癌細胞增殖、侵襲功能的影響，并探討其作用機制。方法： 通過Western印跡法以及實時定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR)技術檢測雌激素作用與Smad1表達的相關關系；采用小發卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)干擾技術下調乳腺癌細胞中Smad1表達，并檢測其對雌激素作用的影響。通過Transwell法、免疫組化法(IHC)、細胞計數法等研究Smad1表達情況對乳腺癌細胞增殖、侵襲能力的影響。結果： Smad1能夠在雌激素刺激下提高其轉錄和翻譯效應，雌激素作用4 h后磷酸化Smad-1(p-Smad1)被激活，并在12 h達到最大值(P<0.001)。乳腺癌腫瘤組織中Smad1的表達強于癌旁組織，且Smad1水平與雌激素受體α(ERα)正相關，而p-Smad1的活化被抑制。應用RNA干擾技術沉默兩種乳腺癌細胞中Smad1后，細胞體外增殖速度顯著下降(P<0.05)；在體內試驗中，腫瘤的生長也受到顯著抑制(P<0.05)。結論： 雌激素對乳腺癌細胞的促增殖和遷移作用依賴于Smad1；骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)-Smad1途徑在雌激素促乳腺癌發生和發展過程中可能發揮重要的調節作用。

[關鍵詞]Smad1；乳腺癌；雌激素受體

乳腺癌是目前嚴重危害女性健康與生命的惡性腫瘤之一，其發病率與致死率均呈逐年上升的態勢。目前全球每年約有120萬名婦女發生乳腺癌，有50萬名婦女死于乳腺癌。統計結果顯示美國2013年即有23萬例女性罹患乳腺癌，在女性新發惡性腫瘤中占30%，成為女性中發病率居首位的惡性腫瘤[1]。諸多研究表明，乳腺組織內較高水平的雌激素表達在乳腺癌的發生發展中起重要作用，臨床上也常將雌激素受體作為乳腺癌內分泌治療的重要靶點。雌激素和雌激素受體已被證明在乳腺、子宮和卵巢等婦科癌癥中具有促進腫瘤細胞有絲分裂的作用[2]。這些激素敏感性癌癥的病因已經表明，雌激素可刺激引發不受機體監管的惡性細胞增殖，從而干擾正常生理過程，驅動腫瘤形成或惡化[3-4]。

骨形成蛋白(BMP)屬于轉化生長因子β(TGF-β)超家族，不僅在胎兒期和胎兒出生后的成長發育起重要作用，而且通過調節細胞分化、增殖、凋亡和遷移維持各組織器官的動態平衡[5-8]。由于BMP在骨形成和骨轉換中發揮關鍵作用，這些分子在骨轉移中的作用近年來被深入探討[9-10]。乳腺癌中主要的骨病變是溶骨導致的骨痛、骨折、脊髓壓縮和高鈣血癥。對BMPs及其在乳腺癌中所發揮作用的關注度日益見增，該方面研究也取得了實質性進展。雖然它的機制尚不清楚，骨形成蛋白在乳腺癌治療中的潛力已不言而喻。

骨形成蛋白，類似于TGF-β，主要是通過Smad通路來誘導細胞應答[11-12]，雖然它們還可以激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路[13-14]。BMP-Smad1通路與胚胎發育和維持組織穩定相關[15]。研究發現，該通路對DNA損傷應答和腫瘤發生起關鍵作用。當發生基因毒性刺激時，BMP激活的Smad1的絲氨酸239位在細胞核內被ATM(ataxia telangiectasia-mutated gene，共濟失調毛細血管擴張突變蛋白酶)磷酸化，破壞了Smad1和蛋白磷酸酶(PPM1A)的相互作用，使得Smad1的激活和上調被增強。進而，Smad1通過和p53相互作用抑制Mdm2(murine double minute2，雙微基因)介導的p53泛素化和降解。最終，細胞增殖與生存得到調節[16-19]。因此，對于BMP-Smad1通路在乳腺癌的腫瘤形成過程，特別是在其細胞周期與凋亡中所起作用的研究意義重大。

1材料和方法

1.1患者與樣本采集本研究收集的腫瘤組織樣本來自于江蘇省腫瘤醫院自2014年11月20日至2015年3月20日期間行根治性切除術的6例乳腺癌患者。該項目經當地倫理委員會批準，所有患者均已簽署相關知情同意書。

1.2細胞培養MEFs(小鼠成纖維細胞)、乳腺癌MCF-7細胞、乳腺癌MDA-MB-231細胞均采用DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培養基，內添加10%胎牛血清，常規培養于在37℃，5%CO2的細胞培養箱。細胞傳代比率為1∶3，每周給細胞更換新鮮培養基2～3次。

1.3蛋白質印跡法采用考馬斯亮藍法(Bradford法)檢測標本抽提液中總蛋白的濃度，操作步驟參照說明書。抗Smad1抗體[Anti-Smad1(9743)]，Smad5(9517)，p-Smad1/5/8(9511)均購自美國CST公司，β-actin(SC81178)抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.4實時定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)細胞或組織抽提總RNA，按反轉錄以及擴增試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書要求進行反應。引物序列：Smad1 S-5′-AAACAGGGCGATGAAG-3′，AS-5′-AGTGAGGAAACGGGTG-3′；GADPH S- 5′-AATCCCATCACCATCTTC-3′，AS- 5′-TCACG-CCACAGTTTCC-3′。實驗重復3次。

1.5免疫組化法(immunohistochemistry，IHC)組織切片在二甲苯中脫石蠟，然后在乙醇溶液中水化，透于0.1%的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)中，孵一抗，4℃，溫育過夜；室溫下，在PBS(phosphate buffer saline，磷酸緩沖鹽溶液)中洗滌3次后，將載玻片與生物素化的羊抗兔二抗進行反應30 min；使用二氨基聯苯胺-四鹽酸顯色后，將載玻片用蘇木精進行復染，并封片。陰性對照組用PBS孵育。

1.6Smad1的敲除siRNA(小干擾RNA，美國Thermo Scientific公司和Santa Cruz公司)被用于Smad1的瞬時敲除；而后又通過反轉綠病毒載體測試了利用4種shRNA(37928，31427，32418和30824，Dharmacon公司)穩定敲除后Smad1的表達情況，其中的2種shRNA(37928和30824)效果顯著并且被我們用于后續的研究。相關實驗重復3次。

1.7MTT法[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]檢測細胞增殖實驗將1 000～2 000個經過處理的乳腺癌細胞接種于96孔培養皿中，于37℃、5%CO2孵箱中孵育；每天取出一塊96孔板加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL/孔，37℃，繼續孵育4 h后，棄上清，每孔加入150 mL DMSO(二甲基亞砜)，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，在490 nm處測定光密度(D)值，根據D值繪制細胞生長曲線，連續檢測4 d。

1.8細胞劃痕實驗細胞以1×105/孔接種于6孔板，常規培養；待細胞80%～90%融合時，棄去培養基，PBS漂洗，用Tip頭(一次性吸頭)在皿底劃一直線，PBS漂洗2次。分別在0、24 h于倒置顯微鏡下拍攝

1.9乳腺癌裸鼠模型建立乳腺癌細胞株混懸于200 μL PBS溶液中，并接種于6周齡大的雄性裸小鼠(購自上海斯萊克公司)肩胛部皮下，每組6只，接種于每只小鼠的細胞總數保持在5×106。接種4周后，測量腫瘤大小，體積估算公式：V(體積)=0.52×L(長度)×W(寬度)。

1.10統計學處理應用SPSS 19.0軟件系統，采用Pearson相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1雌激素激活乳腺癌細胞中BMP/Smad1通路在小鼠成纖維細胞系中，雌激素作用4 h后p-Smad1被激活，并在12 h達到最大值，此結果在蛋白質和mRNA水平均可得到驗證(圖1A、1C)。雌激素能激活小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)、乳腺癌MCF7細胞系以及MDA-MB-231細胞系中的BMP-Smad1通路(圖1C、1D)。實驗結果表明Smad1作為BMP-Smad1中的關鍵基因，能夠在雌激素刺激下提高其轉錄和翻譯效應。

圖1　雌激素激活BMP/Smad通路A, B: Western印跡顯示p-Smad1/5/8 的表達;C, D: real-time PCR顯示Smad1的表達. *P<0.05, **P<0.01

2.2BMP/Smad1通路在乳腺癌組織中被激活，并與雌激素受體表達正相關通過Western印跡技術，在6例乳腺癌患者的組織標本中發現, 腫瘤組織中Smad1的表達強于癌旁組織，且Smad1水平與ERα正相關，而p-Smad1的活化被抑制(圖2)，這可能與BMP受體突變有關，這表明BMP-Smad1途徑在乳腺癌細胞發生發展的過程起復雜的調節作用。

圖2　BMP/Smad1通路在郛腺癌組織中被激活，并且與雌激素受體表達正相關A: p-Smad1/5/8的表達; B: Smad1的表達

2.3雌激素促乳腺癌細胞增殖遷移作用部分依賴于Smad1本研究在Smad1敲除的乳腺癌細胞中發現，雌激素對細胞增殖和遷移的影響會被削弱，提示雌激素對細胞的操控作用部分依賴于高表達的Smad1(圖3)。利用乳腺癌MCF-7和MB-231行裸鼠體內成瘤實驗，在雌激素作用下，敲除了Smad1的腫瘤體積小于對照組(圖4A、4B)。

3討論

在發達國家，乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，也是其女性中癌癥相關致死的首要原因[20]。乳腺癌作為一種臨床和生物學上的異質性疾病，可由多個細胞通路的異常調節所誘導，對失調通路的研究有助于解釋腫瘤的發生[21-24]。

乳腺組織內較高水平的雌激素表達在乳腺癌的發生發展中起重要作用。研究表明，雌激素可刺激引發不受機體監管的惡性細胞增殖，從而干擾正常生理過程，驅動腫瘤形成或惡化[3-4]。ER-配體復合物直接與特定的DNA序列即雌激素反應元件(ERE)結合，與共促進蛋白或共阻遏蛋白相互作用來調節的雌激素相關基因的轉錄，調節包括腫瘤發生和進展在內的各種生理和病理過程[25]。

圖3　下調Smad1表達后，乳腺癌細胞的增殖能力明顯下降A:Western 印跡結果;B:MB-231的增殖情況;C:劃痕試驗. P<0.05

圖4　下調Smad1表達后，利用雌激素治療荷瘤小鼠的腫瘤生長情況

BMPs屬于TGF-β超家族，與TGF-β一樣，盡管可以激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，但BMP主要通過Smad通路引發細胞應答[11-12]。在Smad通路中，有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的1型及2型受體和細胞內的Smad蛋白將信號從細胞表面傳遞入細胞核，并在核中與其相關聯的轉錄因子結合來調節下游基因轉錄。

本研究發現，雌激素能在小鼠胚胎成纖維細胞和乳腺癌細胞系中激活BMP-Smad1通路。在乳腺癌細胞系中，Smad1表達增強，促進細胞增殖和遷移。在Smad1敲除的乳腺癌細胞中，雌激素對細胞增殖和遷移的影響會被削弱，提示雌激素對細胞的操控作用部分依賴于高表達的Smad1。

Smad1作為BMP-Smad1中的關鍵基因，能夠在雌激素刺激下提高其轉錄和翻譯效應。在小鼠胚胎成纖維細胞中，雌激素作用4 h后p-Smad1被激活，并在12 h達到最大值，此結果在蛋白質和mRNA水平均可得到驗證。而在乳腺癌患者的樣本中，Smad1表達上調與p-Smad1的活化被抑制，我們認為這可能與BMP受體突變有關，體現了BMP-Smad1途徑在乳腺癌細胞發生發展過程中調節作用的復雜性。雌激素調節乳腺癌細胞增殖和遷移的過程除了依賴于Smad1以外，還存在其他通路與其交叉作用。由于BMP本身還可以通過激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路[13-14]來影響乳腺癌細胞的生物進程，因此進行更深入的研究來探索兩條通路之間的交叉作用靶點，能夠更好的闡明雌激素促乳腺癌細胞增殖的作用機制。尋找雌激素促進乳腺癌細胞增殖作用的關鍵靶點，可為乳腺癌的臨床治療提供藥物靶標，因此對雌激素促進乳腺癌細胞增殖具體通路機制的深入研究顯得尤為重要。

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[本文編輯]李子卓，賈澤軍

Smad1 involves in regulating proliferation effect of estrogen in breast cancer cells

WANG Jing, ZHANG He-da, LI Jian, ZHAO Jian-hua, WU Jian-zhong, TANG Jin-hai*

The Fourth Clinical School of Nanjing Medical University, Nanjing 210009, Jiangsu, China

[Abstract]Objective： To investigate the interaction between Smad1 and estrogen in the promotion of breast cancer, as well as its functional role and underlying mechanism.Methods： The interaction relationship of Smad1 and estrogen was detected by Western blotting and real-time PCR. Smad1 was down-regulated using short hairpin RNA (shRNA) interference technology in breast cancer cells. Using Transwell method, IHC and cell counting method to observe the effect of Smad1 on cell proliferation and invasion.Results： Smad1 could increase transcription and translation of breast cancer cells in the stimulation of estrogen. p-Smad1 was activated after four hour activation of estrogen and then reach maximum at twelve hour later (P<0.001). The expression of Smad1 in cancer tissue was enhanced compared to paratumor tissues and Smad1 level was positively correlated with ERα while p-Smad1 activation was inhibited. In vitro cell proliferation, RNA interference silencing of Smad1 in two breast cancer cells decreased propagation ability significantly (P<0.05); in vivo tests, tumor growth was also significantly inhibited (P<0.05).Conclusions： The study indicates estrogen manipulation in breast cancer cells depending on Smad1. BMP-Smad1 pathway plays complex controlling role in the process of cell occurrence and development.

[Key Words]Smad1; breast cancer; ER

[中圖分類號]R 737.9

[文獻標志碼]A

[作者簡介]王景，碩士生. E-mail: 2234964343@qq.com*通信作者(Corresponding author). Tel:025-83283364, E-mail: DOCTJH@163.com

[基金項目]國家高技術研究發展資助項目(“863”項目，2014AA020604)，國家自然科學基金 (81272470)，江蘇省科技計劃面上項目(201513279). Supported by “863” project(2014AA020604) , National Natural Science Foundation of China (81272470), and Science Project of Jiangsu Province(201513279).

[收稿日期]2016-02-14[接受日期]2016-04-01