供體同源臂長度對ZFN介導的同源重組效率的影響*

聶 宇，喬艷樂，陳瑤生，何祖勇

(中山大學生命科學學院∥有害生物控制與資源利用國家重點實驗室,廣東 廣州510006)

供體同源臂長度對ZFN介導的同源重組效率的影響*

聶 宇，喬艷樂，陳瑤生，何祖勇

(中山大學生命科學學院∥有害生物控制與資源利用國家重點實驗室,廣東 廣州510006)

應用鋅指核酸酶(Zinc Finger Nuclease，ZFN)和序列同源的供體(Donor)作為模板，借助DNA的同源重組修復機制能夠對動物基因組實現精確的遺傳修飾。目前關于供體長度與ZFN介導的同源重組修復效率相關性的報道相對較少。本研究構建了一對靶向EGFP的ZFN并鑒定了活性，同時設計了一系列不同長度的供體，應用流式細胞分析術，在穩定整合了帶有移碼突變的EGFP基因的CHO細胞中系統分析了供體長度對ZFN介導的同源重組修復效率的影響。結果發現當同源臂單臂僅有50 bp時，即可有效支持ZFN介導的同源同組，隨著同源臂長度的延伸，同源重組的效率有所提高，但要實現高效率的同源重組(較傳統方法提高104倍)，同源臂單臂長度需要延長至1 000 bp以上。這為今后如何設計合適的Donor，以提高ZFN等基因組編輯工具介導的同源重組效率提供了借鑒。

鋅指核酸酶； DNA雙鏈斷裂； 同源重組； 供體； 同源臂

基因組修飾在生物學、醫學和農業等領域都有十分重要的應用價值，但是傳統的基因打靶效率偏低使該技術的發展受到限制[1]。鋅指核酸酶(Zinc Finger Nuclease，ZFN)是一種強有力的基因組編輯工具，使基因打靶的效率比傳統方法提高了100～10 000倍。ZFN是由特異性識別DNA序列的Cys2-His2鋅指結構域和非特異性核酸內切酶FokⅠ切割結構域組成，能夠在基因組特定位點上進行切割，引起DNA雙鏈斷裂(double-strandbreak，DSB)。對ZFN引起的DSB，細胞可通過非同源末端連接(non-homologousend-joining，NHEJ)或者同源重組(homologousrecombination，HR)兩種不同的途徑進行修復。非同源末端連接僅促使斷裂DNA片段末端進行結合，是一種易錯的修復方式，通常會在ZFN切割位點處產生DNA的插入和缺失 (Indel)。同源重組可以利用序列同源的供體(Donor)作為模板修復DNA斷裂，能夠對基因組實現精確的遺傳修飾[2-3]。在有供體存在時，特定細胞中ZFN引起的DSB最高能以50%的概率發生同源重組[4]。

目前ZFN介導的同源重組技術已應用于果蠅[5]、斑馬魚[6]、小鼠[7-8]、大鼠[9]、豬[10-11]、擬南芥[12]、人體細胞[13]等多種動植物的基因修飾。其中，介導重組所用的Donor片段長度從0.75～2.3kb不等，在不同的細胞系中獲得的重組效率也不盡相同[4, 13-15]。然而關于Donor同源臂長度對ZFN介導的同源重組效率影響的研究仍較缺乏。本研究采用一系列不同長度的Donor，在穩定表達EGFP的CHO細胞中，系統比較了ZFN介導的同源重組效率，發現ZFN可以利用短至50bp的同源臂單臂來實現同源重組，但要實現較高效的同源重組，同源臂單臂長度需延長至1 000bp以上，為今后研究中如何設計Donor提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

CHO細胞購于美國ATCC生物資源中心。pEGFP-N1購于Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1ZFN表達載體構建 本文中所采用的ZFN源自Maederetal[16]中的靶向EGFP基因的一對ZFN(EG502ApairA)。

使用VectorNTI軟件根據氨基酸序列反推出ZFP的DNA序列，和FokⅠ序列拼接后，由生工生物公司進行了人源化優化后合成。用EcoRⅠ和NotⅠ對pEGFP-N1進行雙酶切，將合成的DNA片段克隆進載體，獲得一對ZFN的表達載體。

1.2.2EGFP移碼突變載體pEGFP-N1-FS(frameshift)的構建 兩對引物(表1)，以pEGFP-N1為模板，擴增產生移碼突變的左臂(FSLarm)和右臂(FSRarm)兩個片段。其中擴增FSLarm的下游引物FSLarmR和擴增FSRarm的上游引物FSRarmF的5′端均添加了AflⅡ酶切位點。擴增得到的FSLarm和FSRarm分別克隆到T載體，用EcoR I和AflⅡ從T載體上將FSLarm片段切下，與另一個T載體上的FSRarm拼接成發生了移碼的EGFP片段(EGFP-FS)。用Hind Ⅲ和XbaⅠ將EGFP-FS切下，克隆進pEGFP-N1載體，獲得pEGFP-N1-FS表達載體，載體上的EGFP基因中含有8個堿基的插入(圖1)，使EGFP產生移碼突變，無法正常表達綠光熒光蛋白。

圖1 pEGFP-N1-FS表達載體圖譜Fig.1 pEGFP-N1-FS vector map

1.2.3 細胞轉染 CHO細胞在含有φ=10%胎牛血清和雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)的DMEM培養基中生長至80%～90%匯合度時，先用PBS洗滌兩遍，然后用胰酶消化2 min，隨后加入血清終止消化，將消化后的細胞收集至15 mL的離心管進行離心，棄上清后再用PBS洗滌一遍進行第二次離心。離心后棄上清，然后用適量Buffer R (Life Technology)溶液重懸細胞，使細胞密度達到每mL 1.0×107個細胞，加入2 μg質粒，使用Neon轉染系統(Life Technology)對CHO細胞進行電擊轉染。轉染條件為：電壓1 650 V，脈沖10 ms，脈沖次數3次。細胞轉染后接種至含血清無抗生素的DMEM培養基中培養中，24 h后更換培養基，添加雙抗，在φ=5%的CO2、37 ℃條件下繼續培養。2 d后進行流式分析或者收取細胞提取DNA進行后續實驗。

1.2.4 穩定表達pEGFP-N1和pEGFP-N1-FS的CHO細胞的獲得 CHO細胞分別電轉染pEGFP-N1和pEGFP-N1-FS質粒后，在細胞培養基中添加800 ng/mL 的G418，進行為期14～20 d的篩選，分別獲得穩定表達pEGFP-N1的CHOEGFP和pEGFP-N1-FS的CHOEGFP-FS細胞群。

1.2.5 T7EI酶切檢測 使用組織/細胞提取試劑盒(OMEGA公司)提取細胞的基因組，使用D1024引物進行PCR擴增出包含ZFN識別位點的長度為1 024 bp的產物，采用Axgene PCR清潔試劑盒(Axgene公司)純化PCR產物。純化后的PCR產物先在高溫下變性，然后經逐步降溫退火形成異源雙鏈DNA，使用T7EⅠ對上述產物進行酶切，如果ZFN有活性，會產生442 bp和588 bp的兩個片段，可以在w=3%瓊脂糖凝膠中分辨出來。最后通過Image J軟件計算ZFN的切割效率，估算其活性。

1.2.6 流式分析 先用w=1%的胰蛋白酶消化貼壁的CHO細胞，用不少于300 μL PBS重懸成單個細胞，用300目濾膜將細胞過濾到流式管中，用FACSAria Ⅱ流式細胞分選儀器分選EGFP陽性細胞，接種培養。用FACScalibur流式細胞分析儀上分析細胞的熒光比例與強度。

1.2.7 不同長度Donor的獲取 以pEGFP-N1為模板，使用引物對D489、D1024、D1550、D1792和D2043(數值代表擴增片段的長度)進行PCR擴增，膠回收后分別獲得不同長度的Donor：Z489、Z1024、Z1550、Z1792和Z2043(圖2)。

2 結果與分析

2.1 ZFN對EGFP基因的敲除效率檢測

穩定轉染：含在穩定表達EGFP的CHOEGFP細胞中轉染ZFN表達質粒，3 d后利用熒光倒置顯微鏡觀察熒光表達情況，與對照(圖3:A)相比，轉染ZFN表達質粒的CHOEGFP細胞中EGFP陰性的細胞的數量明顯增多(圖3:B)。流式分析表明，轉染ZFN后，CHOEGFP細胞中EGFP陽性的細胞的比例降低了12.95%(圖3:C)。

圖2 Donor示意圖Fig.2 Schematic diagram of disgned Donors

圖3 ZFN對CHOEGFP細胞中EGFP基因的敲除檢測Fig.3 Detection of the knock out effect of EGFP gene in CHOEGFP cells by ZFN

瞬時轉染：流式上機檢測，CHO細胞共轉染ZFN表達質粒和pEGFP-N1質粒后，與只轉染pEGFP-N1質粒的對照相比，EGFP陽性細胞的比例下降了52.3%(圖4:A)，細胞中EGFP的平均熒光強度也明顯下降(圖4:B)。表明ZFN對EGFP具有較高的敲除效率。

2.2 T7EI酶切檢測ZFN的切割活性

CHO細胞瞬時轉染ZFN表達質粒和pEGFP-N1質粒后48 h，以及CHOEGFP細胞轉染ZFN表達質粒后48 h，分別提取基因組DNA進行T7EI酶切檢測ZFN介導的EGFP突變頻率。結果如圖5所示， ZFN對瞬時表達EGFP和穩定表達EGFP的CHO細胞中的EGFP基因均有明顯的打靶作用，其中對質粒上EGFP基因的切割效率高達67.66%，對整合在基因組中的EGFP基因的的切割效率也達11.54%，這與流式檢測觀察到EGFP陽性細胞比例降低的結果較為一致。

圖4 CHO細胞瞬時轉染GFP與ZFN后的流式檢測結果Fig.4 Flow cytomety analysis of CHO cells transiently transfected with GFP and ZFN expression vectors

圖5 T7EI酶切結果Fig.5 T7E1 assay reswlts

2.3 ZFN介導的同源重組

利用藥物篩選的方法加入800 ng/mL G418篩選轉染pEGFP-N1-FS為了檢測ZFN是否可以通過同源重組修復途徑將發生了移碼突變的EGFP基因恢復成功能正常的EGFP基因，本研究使用長度為489 bp和1 024 bp的兩個Donor Z489和Z1024，與ZFN表達質粒共轉染CHOEGFP-FS細胞，7 d后通過熒光顯微鏡觀察發現右側同源臂長度僅為50 bp左右的Donor Z489在ZFN作用下，可以修復突變的EGFP基因，使部分CHOEGFP-FS細胞重新表達EGFP蛋白(圖6:A，B)，右同源臂較長的Donor Z1024在ZFN作用下也可以使部分CHOEGFP-FS細胞恢復EGFP表達(圖6:C，D)。流式分析結果顯示，與只轉染Donor的對照相比，共轉染Donor和ZFN后CHOEGFP-FS細胞群中出現EGFP陽性細胞的比例顯著升高。這些結果表明，在Donor存在時，ZFN可以在CHOEGFP-FS細胞中通過同源重組修復EGFP基因。

2.4 同源臂長度對ZFN介導的同源重組效率的影響

在證明ZFN在CHOEGFP-FS細胞中具有介導同源重組的功能之后，本研究進一步通過共轉染ZFN表達質粒和另外3種延長了同源臂的Donor：Z1550、Z1792和Z2043(圖2)，以檢測同源臂長度對同源重組效率的影響。轉染后7 d，通過熒光顯微鏡觀察可以發現，與Z1024 Donor(圖6:C，D)相比，Donor同源臂延長后，CHOEGFP-FS細胞群中恢復EGFP表達的細胞明顯增多了(圖7:A-F)。流式分析結果也證明CHOEGFP-FS細胞群中有較多的細胞恢復了EGFP表達(圖7:G)，且細胞中的平均熒光強度與對照相比也有顯著性的提高(圖7:H)。在這3種Donor中，其中Z1792 Donor相比Z1550 Donor，其右側同源延長了242 bp，在ZFN作用下實現同源重組的效率提高了約2%(圖7:G)；Z2043 Donor相比Z1792 Donor，其左側同源臂延長了251 bp，在ZFN作用下實現同源重組的效率提高了12.5%(圖7:G)。Donor Z489與Z1024在ZFN介導的同源重組作用下，只能使0.8%左右的CHOEGFP-FS細胞恢復EGFP表達(圖6:E)，且兩者之間差異不顯著(圖7:I)。而Donor Z1550、Z1792和Z2043在ZFN介導的同源重組作用下，分別能夠8.67%，10.24%和23.15%的CHOEGFP-FS細胞恢復EGFP表達(圖7:G)。綜合比較5種Donor在ZFN作用下實現同源重組的效率，可以發現當同源臂單臂僅有50 bp時，即可實現有效支持ZFN介導的同源同組，隨著同源臂長度的延伸，同源重組的效率有所提高，但要實現高效率的同源重組，同源臂單臂長度需要延長至1 000 bp以上(圖8，表1)。

圖6 CHOEGFP-FS細胞中ZFN介導的同源重組結果Fig.6 Homologows recombinaton in CHOEGFP-FS cells mediated by ZFN

圖7 3種不同長度Donor在ZFN作用下實現同源重組的效率比較Fig.7 Comparison of the homologows recombinaton efficiencies of three donors with disferent length medrwted by ZFN

圖8 不同長度的Donor在ZFN作用下實現同源重組的效率比較Fig.8 Comparison of the homologows recombination efficiencies of donors with different length mediated by ZFN**：P<0.01

表1 ZFN介導重組實驗中所用的供體同源臂長度

Table 1 Length of homologous arm of donors used in homologous recombination mediated by ZFN

N供體名稱L左側同源臂長度/bpR右側同源臂長度/bpZ48943950Z1024439585Z1550798752Z1792798994Z20431049994

3 討 論

通過同源重組的方法在染色體DSB處實現DNA的精確修復，最關鍵的一個步驟是DNA異源雙鏈結構的形成。這需要細胞募集一系列的重組蛋白來參與DNA的配對重組和修復過程。這些重組蛋白包括RecA家族DNA修復蛋白(RecA-family DNA-repairing proteins)，單鏈DNA結合蛋白(single-stranded DNA binding proteins)，重組調節蛋白(recombination mediator proteins)，退火蛋白(annealing proteins)及各種核酸酶[17]。我們通常把能發生有效同源重組的最小Donor長度稱為最小功能效應片段(minimum effective processing segment，MEPS)[18]，它主要與穩定同源重組中產生的中間結構相關。之前的研究認為細菌中MEPS為50～100 bp，而真核生物中為200～400 bp[19]。

不同物種中同源重組修復對于Donor的長度，濃度要求不同[20]。在酵母中，可以用短至30 bp的Donor實現ZFN介導的HDR，使自發的重組處于非常低的水平[21]，但針對某種NHEJ依賴性更強的酵母種屬，如Yarrowia lipolytica，只有當同源臂大于1 kb時才能實現同源重組修復[22]。在多細胞真核生物中，雖然出現過利用短至25 bp同源序列實現分子間重組(intermolecular recombination)的個例[23]，但是普遍認為要實現高效率的同源重組，Donor長度需大于1 kb[24]，然而當同源臂達到2 kb以上時，同源重組效率不再隨同源臂長度增加而提高[25-26]。與此同時，為了提高HDR效率，研究者更傾向于使用單鏈核苷酸作為供體[20, 25]。

本研究發現右側同源臂僅有50 bp的Z489 Donor即可通過同源重組修復突變的EGFP基因(圖6:A，B，E)，表明ZFN在CHO細胞中，可以利用短至50 bp的同源臂單臂，并且在切割位點與需要修復的突變位點相距達242 bp的情況下，實現精確的同源重組修復。這可能與Rad51發揮功能需要高效搜索50 bp的同源臂相關[27-28]。

ZFN是高效的基因修飾工具。與傳統的基因打靶技術相比，利用ZFN進行基因修復時，使用2 043 bp的Donor可實現23.15%的同源重組，效率提高了23 000倍(23.15% vs 10-4)證明了ZFN是一種高效的基因組編輯工具。此外，本研究發現，延長Donor的，左右同源臂長度可提高同源重組的效率，同Deng在傳統基因打靶中得到的結論一致[29]。CHOEGFP-FS細胞基因組中EGFP移碼突變的位點位于ZFN切割位點左側294 bp處，我們發現Donor的左側同源臂延長后，同源重組的效率得到大幅度的提高。這表明，在同源重組修復過程，可能需要Donor從DSB侵入一條越過突變位點的較長的單鏈作為模板，所以本研究中ZFN介導的同源重組對左側同源臂的的長度具有較高的要求。當左側同源臂向前延長時會包含CMV啟動子的部分序列，尤其是Z2043 Donor的左側同源臂包含了143～394 bp區段的CMV啟動子的核心區域，導致只轉染Donor的細胞，在7后的檢測中，可能因為隨機整合而使部分細胞表達了EGFP，然而通過扣除這些本底表達(圖7:I)，我們仍然可以發現左側同源臂延長后可以提高同源重組的效率。

ZFN介導的同源重組效率隨著同源臂長度的延長而增高；當同源臂單臂的長度增加至1 000 bp時，同源重組效率有較大幅度的提高。因此本研究提示在實驗中需要利用ZFN等基因組編輯工具實現較高的同源重組效率，在設計Donor時，應使同源臂單臂長度應達到1 000 bp以上。

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The effect of the length of donor homologous arm on the efficiency of ZFN-induced homologous recombination

NIEYu,QIAOYanle,CHENYaosheng,HEZuyong

(State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University,Guangzhou 510006, China)

Zinc finger nuclease (ZFN) is composed of an engineered site-specific Cys2-His2zinc finger domain and the nonspecific restriction enzymeFokI cleavage domain, which is able to cut at a specified genomic locus to generate double-strand break (DSB) of DNA. The DSBs induced by ZFN are subsequently repaired through two different DNA repair mechanisms, either non-homologous end-joining (NHEJ) or homology-directed recombination (HDR). NHEJ is prone to introduce sequence insertions or deletions (indels), and can therefore produce frameshifts in open reading frames and gene loss of function. HDR requires a donor template with the sequence similar to the genome to mend a lesion. By introducing a DNA donor with desired modifications, precise genomic modifications can be achieved at a frequency improved 102-104-fold as compared to the traditional gene targeting method. Currently, most studies have focused on screening ZFN with higher activity, and improving the delivery efficiency of ZFN and donor into host cells, less studies have investigated the relationship between the homologous arm length with the efficiency of ZFN induced homologous recombination. Here, we constructed a pair of ZFN plasmids targeting to EGFP and verified its cutting activity. Then we designed a series of donors with different lengths of homologous arms. By introducing individual donor with ZFN into CHO cells harboring a frame-shift GFP gene, we measured the homologous recombination efficiencies through the flow cytometric analysis. We found that a 50 bp short homology arm was capable to support ZFN-mediated homologous recombination. Increasing the length of the homologous arms could improve the efficiency of ZFN-mediated homologous recombination. A dramatic improvement (104-fold higher than traditional method) requires a homology arm longer than 1 000 bp.

zinc finger nuclease; double-strand break; homologous recombination; donor; homologous arm

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.04.017

2016-01-26

國家轉基因生物新品種培育重大專項資助項目(2016ZX08006003-006)；NSFC-廣東省聯合基金資助項目(U1201213)

聶宇(1989年生)，男；研究方向：動物學；通訊作者：何祖勇;E-mail:zuyonghe@foxmail.com

Q78

A

0529-6579(2016)04-0100-08