全自動精漿果糖檢測方法的建立及主要性能評價*

郭麗媛 孫筱放 周 華 袁靜茹 劉 敏

廣州醫科大學附屬第三醫院婦產科研究所，廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室（廣州 510150）

全自動精漿果糖檢測方法的建立及主要性能評價*

郭麗媛 孫筱放 周 華 袁靜茹 劉 敏

廣州醫科大學附屬第三醫院婦產科研究所，廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室（廣州 510150）

目的建立全自動精漿果糖檢測方法并對其準確度、精密度及線性范圍等進行評價。方法在全自動特定蛋白分析儀上利用己糖激酶法檢測精漿果糖，評估該方法的準確度、精密度及線性范圍，并與臨床上常用的吲哚顯色法進行比較。結果果糖質控品檢測結果在其定值范圍內。回收試驗結果獲得回收率分別為96.15% 和103.37%。全自動己糖激酶法測定精漿果糖精密度高，批內精密度與批間精密度的CV值分別為0.63%和1.27%。精漿果糖濃度在0.065~4.16mmol/L范圍內，具有良好的線性關系（r2= 1.00）。分別采用吲哚顯色法與全自動己糖激酶法檢測105個精漿標本的果糖濃度，兩種方法的檢測結果因其方法學不同而存在差異（P＜0.01），但兩種方法的檢測結果呈顯著正相關（r2=0.96 ，P＜0.01），線性回歸方程為：y= 1.19x+1.67 （R2=0.93，P＜0.01）。結論本研究建立的全自動精漿果糖檢測法具有良好的準確度與精密度，與臨床常用方法有較好的相關性。該法操作簡單，安全快速，更適用于臨床大批量樣本的檢測，建議在男性學實驗室推廣。

精液; 果糖; 己糖激酶

精漿果糖由精囊腺分泌，是精子活動的主要能量來源，直接參與精子獲能和授精。精子軸絲收縮依賴ATP供給能量，而ATP可由果糖分解代謝產生，因此精漿果糖濃度減低將使精子活動力減弱，影響受精率。精子運動與果糖酵解成正相關，果糖分解率越高，精子活動也越強，所以精漿果糖含量與男性生育力密切相關[1]。有多項研究發現，精漿果糖與精子密度呈顯著負相關[2-4]。而精液中低果糖濃度是射精管阻塞、雙側輸精管先天性缺如、不完全逆行射精和雄激素缺乏的特征[5]。Buckett等首次報道非阻塞性無精子癥患者精漿中果糖濃度升高[6]，測定精漿果糖含量將有助于輔助診斷阻塞性無精子癥和非阻塞性無精子癥。

目前，用于檢測精漿果糖的方法有氣相層析法、間苯二酚顯色法和吲哚顯色法等多種方法[7]。大多數關于精漿果糖的文獻報道基本以間苯二酚法[2,8,9]和吲哚顯色法[4,10]為主，并且 吲哚顯色法為WHO推薦方法[5]，但是這兩種方法的操作程序都較繁瑣，標本前期需要去蛋白處理且實驗過程需要濃鹽酸參與反應。隨著臨床標本量日益遞增，臨床上需要更方便快捷的方法來提高檢測效率，全自動檢測是一種必然的發展趨勢。

因此，本研究從臨床實際出發，以己糖激酶法為基礎建立了全自動精漿果糖的定量檢測方法并對其進行主要的性能評價。

材料與方法

一、試劑與儀器

（一）主要試劑

果糖測定試劑盒（己糖激酶法）（重慶博士泰生物技術有限公司），包括：R1試劑，主要由PIPES，NADP+，己糖激酶，磷酸葡萄糖異構酶和疊氮鈉組成；R2試劑，ATP ，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和疊氮鈉組成；4.16mmol/L果糖標準液。精漿果糖定量檢測試劑盒（吲哚顯色法）（按照WHO第五版[5]標準自行配制）。果糖質控品（定值范圍6.49~9.38mmol/L，BioSystems）

（二） 主要儀器

A 1 5全自動特定蛋白分析儀（西班牙BioSystems）。

二、 檢測原理

D-果糖與ATP在己糖激酶的催化下生成果糖-6-磷酸及ADP，果糖-6-磷酸在磷酸葡萄糖異構酶催化下生成葡萄糖-6-磷酸，后者與NADP+在G-6-PDH的作用下生成葡萄糖酸-6-磷酸+NADPH+H+。樣本中的果糖含量與酶促反應產物的吸光度的變化值成正比，通過測定340nm波長處NADPH上升的吸光度值即可計算出果糖的濃度。

三、檢測方法

（一） 具體步驟

受試者禁欲2~7d，通過手淫法或用特制的精液采集套留取全部精液標本，記錄精液樣本的總體積，精液液化混勻后，取部分標本以3 000×g，離心15min后留取上層精漿。取200μL精漿與800μL純水混勻后直接上機檢測。

（二） 基本參數

主波長：340nm；副波長：（670±10）nm；反應溫度：37℃；反應時間：6min；樣本/試劑R1/試劑R2：1/20/5；分析方法：終點法。

四、準確度測定

（一）質控品檢測

果糖質控品隨精漿標本上機檢測。

（二）回收試驗

選取2份精漿標本作為基礎樣本，4.16mmol/L的果糖標準液作為回收樣本，計算各自的回收率。

五、精密度測定

取凍存的混合精漿，采用全自動己糖激酶法一批內連續檢測20次，分別計算出均值和標準差，得出批內變異系數（CV）；取果糖標準液，連續測定20d，計算均值和標準差，得出批間變異系數（CV）。

六、線性分析

將4.16mmol/L果糖標準液加純水稀釋，得到另外6個標準液：2.08，1.04, 0.52, 0.26, 0.13, 0.065mmol/L，使用儀器自動檢測獲得結果，以理論值與實際測定值繪制相關曲線，計算相關系數（r）。

七、方法學比較

選取105個不育男性的精漿標本，標本來源于廣州醫科大學附屬第三醫院婦研所實驗部男性學實驗室，其中無精子癥10例，少精子癥24例，正常精子濃度71例。3 000×g，離心15min后留取上層精漿，分別利用全自動己糖激酶法與吲哚顯色法進行檢測，具體操作按各自的說明書進行。對兩種方法的檢測結果進行統計學分析。

八、統計學分析

數據以均數±標準差表示，用SPSS16.0統計軟件對兩種方法學比較結果進行配對t檢驗，Pearson相關性分析及線性回歸分析，采用Microsoft Excel軟件進行線性相關與回歸作圖，以P＜0.01為有統計學意義。

結 果

一、準確度檢測

（一）質控品檢測結果

果糖質控品檢測結果在定值范圍（6.49~9.38mmol/L）內。

（二）回收試驗

采用全自動己糖激酶法檢測2份精漿樣本的基礎管，測得的果糖濃度分別為3.56mmol/L和0.80mmol/ L, 相應測定管的濃度為3.96mmol/L和1.23mmol/L。計算獲得該方法的回收率分別為96.15% 與103.37%。

二、精密度檢測

批內精密度檢測結果為（8.46±0.05）mmol/L，CV值為0.63%；批間精密度檢測結果為（4.20±0.05）mmol/L，CV值為1.27%。

三、線性分析

結果顯示：果糖濃度在0.065~4.16mmol/L范圍內，具有良好的線性關系（r2=1.00），見圖1。

圖1 果糖濃度檢測的線性分析

四、方法學比較

以吲哚顯色法為對照方法，全自動己糖激酶法為試驗方法，兩者檢測105個精漿標本的果糖濃度結果分別為（37.74±32.17 ）mmol/L與（ 46.72±39.83）mmol/L。配對t檢驗結果顯示，兩種方法的檢測結果存在差異且具有統計學意義（P＜0.01）。Pearson相關性分析顯示，兩種方法的檢測結果呈顯著正相關（r=0.96 ），相關具有統計學意義（P＜0.01）。將兩種方法的檢測結果進行線性回歸分析，得出的線性回歸方程為y=1.19x+1.67（R2=0.93 ，P＜0.01），見圖2。

圖2 線性回歸擬合圖

討 論

精漿果糖是精漿生化中的一項重要指標，對于不育癥的診治具有重要意義。目前，精漿果糖檢測已在臨床上廣泛開展。WHO推薦的精漿果糖定量檢測方法為吲哚顯色法，然而這種方法學存在以下不足之處：（1）反應特異性不夠理想；（2）在濃鹽酸環境下反應， 由于濃鹽酸易揮發，易造成反應重復性差，尤其是標本檢測量大時，由于操作時間的延長，這種現象更為明顯；（3）生物安全性差，強酸易污染環境及易腐蝕儀器[11]。

為了滿足臨床大批量標本的檢測，本研究采用己糖激酶法在全自動特定蛋白分析儀上開展精漿果糖的測定，其操作簡單，反應快速。實驗結果顯示該法具有良好的準確度和精密度，果糖質控品的檢測值在其定值范圍內。回收試驗的結果顯示2份精漿樣本的回收率分別為96.15% 與103.37%，均在允許的范圍之內（95%~105%）。 批內精密度檢測CV值為0.63%，批間精密度檢測CV值為1.27%，能滿足臨床要求。精漿果糖濃度在0.065~4.16mmol/L范圍內，線性關系良好（r2=1.00）。

在方法學對比試驗中，我們選擇了105個不育男性的精漿標本進行吲哚顯色法和全自動己糖激酶法的平行檢測，發現兩種方法的檢測結果可能因為方法學的不同而存在差異，這與何小紅等[11]先前的報道結果相似，但這并不影響精漿果糖（己糖激酶法）在臨床中的應用。而本文研究的全自動己糖激酶法與吲哚顯色法的檢測結果具有良好的相關性（r2=0.96），并且通過線性回歸分析獲得線性回歸方程為y=1.19x+1.67（R2=0.93）。

與吲哚顯色法比較，全自動己糖激酶法無需進行反應前的去蛋白處理，亦無需在實驗過程中添加濃鹽酸參與反應，這將大大的簡化了操作流程及提高了實驗的安全性與穩定性。在反應時間上，吲哚顯色法至少需要55min，而全自動己糖激酶法的反應時間是6min，可見全自動己糖激酶法具有更高的檢測效率，更能滿足大批量標本的檢測需求。既往研究報道，己糖激酶法是理想的方法學，除了試劑價格相對較高之外，具有吲哚顯色法不可比擬的優點，是精漿果糖檢測方法學的發展趨勢[11]。而陸金春等[12]建立了另外一種全自動檢測法——精漿果糖速率法，并從多方面證明其實用性，但該法與吲哚顯色法的相關性（r2=0.94）不如本研究中建立的全自動己糖激酶法（r2=0.96）。

總之，本研究將己糖激酶法與全自動特定蛋白分析儀相結合而建立起來的全自動精漿果糖檢測方法，既具有酶法的優點，又有全自動檢測的優勢，能更好的滿足臨床需求，有希望在男性學實驗室中進一步推廣應用。

1 熊承良, 商學軍, 劉繼紅主編. 人類精子學. 北京: 人民衛生出版社, 2013:13,153-474

2 Andrade-Rocha FT. Seminal fructose levels in male infertility: relationship with sperm characteristics. Int Urol Nephrol 1999; 31(1): 107-111

3 王瑞雪, 劉睿智, 袁寶明, 等. 精漿果糖含量、中性α-糖苷酶和酸性磷酸酶活性與精液參數關系研究. 中國計劃生育學雜志 2006; 14(6): 353-355

4 陳秀玲, 韓艷君, 錢聰, 等. 不育男性精漿果糖含量與精子參數的關系. 實用醫學雜志 2009; 25(12): 1975-1977

5 谷翊群, 陳振文, 盧文紅, 等譯. WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊. 北京: 人民衛生出版社, 2011:113

6 Buckett WM, Lewis-Jones DI. Fructose concentrations in seminal plasma from men with nonobstructive azoospermia. Arch Androl 2002; 48 (1) :23-27

7 蔣敏, 岳煥勛, 張思孝. 精漿果糖測定研究進展. 四川醫學 2005; 26(6): 675-677

8 劉克鋒, 王瑞, 李銳, 等. 不育癥患者精漿果糖水平測定.鄭州大學學報?醫學版 2009; 44(3): 495-496

9 Al-Daghistani HI, Hamad AW, Abdel-Dayem M, et al. Evaluation of serum testosterone, progesterone, seminal antisperm antibody, and fructose levels among jordanian males with a history of infertility. Biochem Res Int 2010; 2010: 409640

10 毛金觀, 蔡文偉. 無精子癥、少弱精子癥患者精子質量與精漿果糖相關性研究. 中國衛生檢驗雜志 2014; 24(3): 395-396

11 何小紅, 劉瑜. 精漿果糖定量檢測試劑盒性能評價. 中國男科學雜志 2005; 19(5): 51-53

12 陸金春, 盧坤剛, 張紅燁, 等. 精漿果糖速率檢測法的初步評價. 臨床檢驗雜志 2015; 33(1): 6-8

（2016-08-28收稿）

Performance evaluation and establishment of an automatic assay on seminal fructose level

Guo Liyuan, Sun Xiaofang, Zhou Hua, Yuan Jingru, Liu Min
Institute of Obstetrics and Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Key Lab of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institute, Guangzhou 510150, China

ObjectiveTo establish an automatic assay for seminal fructose level and evaluate its accuracy, precision and linear range.MethodsThe concentration of seminal fructose was measured by hexokinase method on an automatic specifc protein analyzer, and the accuracy, precision and linear range of this method were evaluated , and the results of this method were compared with those of indole chromogenic method commonly used in clinical.ResultsThe result of the fructose quality control determined by the automatic method falls within the scope of value. The recovery rates of the recovery experiment were 96.15% and 103.37%. The automatic method had excellent within-run and between-run precision, and the coeffcients of variation (CV) were 0.63% and 1.27%, respectively. A good linear relationship (r2= 1.00) was shown when the concentration of seminal fructose was between 0.065 and 4.16 mmol /L. Compared with the results of indole chromogenic method , the results of automatic method showed statistical difference (P<0.01) because of different methodologies. But it had a signifcant positive correlation between the results of seminal fructose concentration from 105 seminal samples analyzed by indole chromogenic and automatic method (r2=0.96 ，P<0.01). The linear regression equation: y= 1.19x+1.67 (R2=0.93 ，P<0.01).ConclusionThe established automatic method for analysis of seminal fructose level has good accuracy and precision, and it also has good correlation with the commonly used method in clinical. The operation of this method established in our study is simple, safe and fast. It would be more suitable for analyzing large numbers of samples and it could be applied to andrology laboratory.

semen; Fructose; Hexokinase

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.11.008

R 446.144

資助：廣州醫科大學青年基金（2013A20）