用PCR-DGGE方法分析渤海原油降解過程微生物群落結構變化

王大威, 張健, 馬挺, 呂鑫, 何春百

1. 海洋石油高效開發國家重點實驗室, 北京 100028

2. 中海油研究總院, 北京 100028

3. 南開大學生命科學學院分子微生物學與技術教育部重點實驗室, 天津 300071

用PCR-DGGE方法分析渤海原油降解過程微生物群落結構變化

王大威1,2*, 張健1,2, 馬挺3, 呂鑫1,2, 何春百1,2

1. 海洋石油高效開發國家重點實驗室, 北京 100028

2. 中海油研究總院, 北京 100028

3. 南開大學生命科學學院分子微生物學與技術教育部重點實驗室, 天津 300071

針對渤海油田原油粘度大、含水上升快、常規措施作用不明顯的特點, 采用微生物采油技術開展提高稠油采收率研究。通過室內物理模擬實驗, 結合變性梯度凝膠電泳(Denature Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 技術及原油粘度測定分析研究均質、非均質巖心驅替前后稠油采收率變化、微生物群落豐度結構變化、原油理化性質變化, 嘗試分析微生物提高稠油采收率機理。物模結果表明： 微生物采油體系能夠有效提高稠油采收率, 在均質巖心和非均質巖心驅替中, 微生物體系可分別提高采收率14.4%、29.4%; DGGE結果顯示： 微生物體系出口端豐度明顯高于注入端;原油粘度測定顯示： 出口端原油粘度明顯下降。三者結合說明微生物體系能夠利用稠油作為碳源, 在地層環境中生長,菌種在地層中有較強的適應性, 同時能夠降低稠油粘度, 提高其采收率。

稠油; 微生物采油; DGGE; 降粘; 機理

1 前言

微生物采油技術(Microbial Enhanced Oil Recovery, MEOR)發展至今已有90多年的歷史, 目前MEOR技術已經成功地應用于單井吞吐、調剖、降粘等方面,該技術能夠經濟有效地延長油田開采周期, 提高近枯竭油藏的采收率[1]。但目前該技術的應用受到一定的限制, 主要原因在于微生物采油技術機理較為復雜, 同時油藏作為“黑箱”體系, 科研人員用傳統培養方法所獲得的微生物生態信息遠不能反映油藏環境中的實際情況, 無法有效獲知微生物在地層中運移、群落豐度變化、菌種種群變化等參數, 不能合理對現場試驗結果進行解釋分析, 無法確定提高采收率的主要機理, 因此影響微生物采油技術深入發展的主要難點是缺乏有效的采油微生物群落結構變化與采收率關系分析及動態變化的監測方法[2-5]。

近年來基因組學和現代分子技術的成熟, 逐漸滲透到有關生命科學的整個領域, 也為微生物生態學提供了新的研究方法和機遇。自1985年Pace等以核酸測序技術研究微生物的生態和進化問題以來,對微生物的多樣性研究進入了一個新的階段, 并逐步發展形成了成型的微生物分子生態學(Molecular Ecological Technology of Microorganisms)方法和技術。變性梯度凝膠電泳(Denature Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于檢測DNA突變的一種電泳技術,是一種通過分離微生物基因組DNA 來研究環境樣品中微生物群落的多樣性及物種豐度的一種分子指紋技術[6-8], 1993年Muzyers等首次將DGGE技術應用于分子微生物學研究領域, 并證實了這種技術在揭示自然界微生物區系的遺傳多樣性和種群差異方面具有獨特的優越性。近年來運用分子指紋技術對油藏微生物群落的研究已有不少[9-15], 但少有文獻報道在微生物物理模擬驅油實驗過程中研究采油微生物群落結構變化與采收率動態關系[16-18]。

本文嘗試通過室內物理模擬實驗, 結合變性梯度凝膠電泳(Denature Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 技術及原油粘度測定研究均質、非均質巖心驅替前后稠油采收率、含水、壓力變化、微生物群落豐度結構變化、原油理化性質變化, 以分析微生物提高稠油采收率機理, 為今后微生物采油現場應用效果解釋提供依據。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 地層水、原油樣品： NB35-2 A18井原油, 粘度523.3 mPa·s, 瀝青7.79%, 膠質20.25%; NB35-2 A18井地層水。

2.1.2 發酵培養基 (g·L-1)： Na2HPO40.6, KH2PO40.2, NaNO32, FeSO40.02, MgSO40.3, 酵母粉 0.5,蔗糖 1, pH 7.2。

2.1.3 菌種： 產表面活性劑菌 T-1(Pseudomonas aeruginosa, 銅綠假單胞菌屬)、X-3(Bacillus Subtilis,枯草芽孢桿菌), 由實驗室分離保存; 稠油降解菌：QB26(Bacillus licheniformis, 地衣芽孢桿菌)、QB36 (Geobacillus pallidus, 白色地芽孢桿菌), 由實驗室從NB35-2油田地層油水樣分離保存。

2.1.4 微生物調剖劑： 黃原膠 0.2%、氯化鉻 0.1 M·L-1、醋酸1ml/L, 攪拌混合。

2.1.5 巖心

(1) 均質巖心參數

(2) 非均質巖心參數

2.2 方法

2.2.1 菌種對原油的降粘作用

表1 均質巖心參數Tab. 1 Homogeneous core parameters

利用BROOK FIELD VISCOMETER LVDV-II+Pro提桶式粘度計測定原油和菌種對原油作用后的粘度變化。

表2 非均質巖心參數Tab. 2 Heterogeneous core parameters

2.2.2 菌種的富集培養

將T-1、X-3、QB26、QB36 4菌種在發酵培養基中富集培養后, 按一定比例復配成微生物稠油降粘體系, 體系粘度22.3mPa·s, 備用。

2.2.3 基因組DNA的提取與純化

原始水樣中菌體用孔徑為0.22 μm的混合纖維素酯濾膜抽濾1L水樣來收集, 經培養后的菌體直接取10mL培養液高速離心機上6000 r·min-1速度離心10—15 min獲得。具體操作步驟與文獻[14]相同?；蚪MDNA提取與純化使用北京天為時代生物技術公司的DNA 純化試劑盒, 按照操作說明進行。

2.2.4 16S rDNA 的PCR擴增

采用可得到更多微生物多樣性信息的 V9區引物進行細菌16S rDNA PCR擴增, 因要進行DGGE分析, 故此處的引物帶GC夾子, 細菌V9區： 1406r-GC： 5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCCC ACG GGC GGT GTG TAC-3’; 1055f： 5′-ATG GCT GTC GTC AGC T-3′。

瓊脂糖凝膠電泳檢測： 條帶在400～500bp左右。

2.2.5 16S rDNA 序列DGGE分析

將純化好的PCR 樣品加入制備好的變性膠中,進行電泳分離，并用YLN22000凝膠影像分析系統分析, 觀察每個樣品的電泳圖譜并拍照。

2.2.6 微生物驅油體系在巖心研究的增油效果

均質巖心實驗： 研究不同油藏空隙體積下(PV數)微生物段塞在均質巖心的提高采收率效果。水驅含水 70%后, 倒換閥門, 分別注入微生物段塞(菌液+營養液)0.3、0.6 PV。注入完成關閉巖心夾持器兩端閥門, 悶井 5 d, 同時做空白對照, 直接水驅至含水95%。

非均質巖心實驗： 研究在非均質巖心實驗中加入調剖段塞對微生物采油體系的影響。當水驅油出液量達到0.1 PV時, 水驅含水70%后, 立即倒換閥門轉注0.2 PV調剖段塞(黃胞膠+鎘離子交聯)。當出液量達到0.2 PV時, 立即倒換閥門轉注0.1 PV微生物段塞(營養液+菌液)防止成膠過后巖心注入端堵塞, 出液量達到0.1 PV時, 立即關閉巖心夾持器兩端閥門約3 h等待成膠。成膠后繼續注入0.5 PV混合溶液(營養液+菌液)。注入完成關閉巖心夾持器兩端閥門, 燜井5 d, 水驅至含水95%。同時做空白對照, 只加入微生物段塞 0.6 PV, 注入完成關閉巖心夾持器兩端閥門, 燜井5 d, 水驅至含水95%。

3 結果與討論

3.1 微生物驅油體系在均質巖心中的增油效果

微生物驅油體系在均質巖心中的增油效果見圖1, 同時研究了不同大小的微生物段塞對采收率的影響。

從圖 1可以看出, 微生物段塞大小對最終采收率影響較大。0.3 PV的微生物段塞最終采收率為40.6%, 比水驅提高3.8%; 將微生物段塞倍增后, 0.6 PV的微生物段塞的最終采收率為51.2%, 比水驅提高 14.4%, 說明當微生物段塞的大小超過一定水平,微生物在巖心中分布的范圍更大, 可處理更多稠油,降低稠油粘度, 降低油水流度比, 后續水驅能更大程度的啟動剩余油, 對采收率具有較大的影響。

圖1 均質巖心模型驅替實驗數據Fig. 1 Result of homogeneous cores physical model simulations

圖2 均質巖心驅替后截面圖Fig. 2 Sectional view of homogeneous core flooding

對比驅替后的巖心截面可看到, 空白實驗的巖心內部尚殘留大量原油未被驅出, 而注入0.3 PV和0.6 PV微生物段塞的巖心被驅替的比較充分, 說明微生物注入到均質巖心中, 通過降解稠油和產生乳化劑, 降低了油水流度比, 提高了稠油采收率。

3.2 微生物驅油體系在非均質巖心的增油效果研究

微生物驅油體系在非均質巖心中的驅油效果見圖 3, 研究在非均質巖心中加入生物聚合物前置段塞對采收率的影響。

從圖 3可以看出, 生物聚合物段塞的加入對采收率作用明顯, 不加聚合物段塞的最終采收率為40.8%, 比水驅提高 22.4%, 加入段塞的最終采收率為47.9%, 比水驅提高29.4%, 聚合物段塞的加入有效調節吸水剖面, 封堵高滲條帶, 一方面能夠使注入體系進入中低滲層位, 提高波及效率, 另一方面采油微生物進入中低滲透層后利用其中存在的剩余油, 降低稠油粘度, 提高了驅油效率, 這兩方面均是提高采收率的基本機理, 因而聚合物段塞的加入能明顯提高稠油采收率。

由圖 4所示, 非均質巖心在驅替完成后出現大片淡黃色斑紋, 說明微生物在油藏環境下能夠很好的降解原油, 產生表面活性劑, 同時啟動了中低滲層的稠油, 為后續水驅提供了良好的條件, 進一步提高采收率。

圖3 非均質巖心模型驅替實驗數據Fig. 3 Result of heterogonous cores physical model simulations

圖4 非均質巖心驅替后截面圖(非均質巖心體系2)Fig. 4 Sectional view of heterogeneous core flooding (heterogeneous core system 2)

3.3 驅替實驗前后樣品的DGGE條帶分析

將T-1、X-3、QB26、QB36四株菌種培養物、注入體系(空白 1)、產出液、地層水(空白 2)分別提取DNA, 通過DGGE對不同體系中菌種濃度進行分析, 結果見圖5。從圖中可以看到, QB26作為對稠油降粘起作用的優勢菌種, 產出液中的含量高于注入體系, 同時也高于其他采油菌種, 說明QB26在巖心中可利用稠油作為碳源進行生長, 因其利用稠油和營養的能力更強, 在菌群分布中處于統治地位; QB36同樣作為稠油降解菌, 產出端菌濃也高于注入端, 但明顯低于QB26產出端菌濃, 可能是由于其在地層中利用稠油和注入營養液的能力與QB26相比低下, 因此造成其生長速度低于 QB26, 說明QB26在稠油降粘中起主導作用; T-1、X-3菌種產出端條帶亮度低于注入端, 說明產出端菌濃比注入端低, 原因在于T-1、X-3菌種為產表面活性劑菌種,主要為專性好氧菌, 由于地層深部氧氣含量低, 專性好氧菌在與QB26、QB36等兼性好氧稠油降解菌的競爭中處于下風, 其菌種濃度呈下降趨勢, 主要作用物-表面活性劑(乳化劑)的產生是在發酵罐中進行的, 地層中相應也會產生表面活性劑(乳化劑), 但含量較低。

從不同巖心實驗結果看, 均質巖心實驗中, 均質巖心體系2(0.6 PV)對比均質巖心體系1(0.3 PV),優勢菌 QB26菌濃前者明顯高于后者, 且菌種種類也有所增加, 這說明增大注入體積可提高菌液在巖心中的分布, 促進菌種利用更多剩余油, 結果是一方面增加了菌液濃度, 一方面提高了稠油采收率。

非均質巖心實驗中, 非均質巖心產出端優勢菌QB26菌濃均高于均質巖心, 同時非均質巖心產出端菌種種類多于均質巖心, 分析原因在于： 均質巖心水驅程度較高, 巖心內剩余油含量低, 微生物驅油體系可利用的稠油較少, 而非均質巖心由于存在滲透率級差, 水驅主要動用高滲層位稠油, 而中低滲層位稠油大部分未被啟動, 可作為稠油降解菌的碳源, 故非均質巖心中QB26菌濃高于均質巖心。從非均質巖心實驗中不同段塞結果來看, 加入聚合物段塞的巖心實驗產出端QB26菌濃高于未加入聚合物段塞的巖心。分析原因在于： 盡管注入體系本身具有一定粘度, 但未加入聚合物段塞無法有效調整巖心吸水剖面, 造成注入體系只進入高滲層位, 但高滲層位中的稠油水驅后剩余油含量較低, 同時采油菌因進入中低滲層位較少, 因此無法有效啟動剩余油; 加入聚合物段塞后, 有效控制了吸水剖面,注入體系能夠進入中低滲層位, 并啟動這些部位的剩余油, 微生物可以稠油為碳源生長, 因此其菌濃高于未加入聚合物段塞的巖心實驗結果。

圖5 16S rDNA 擴增產物的DGGE電泳圖Fig. 5 DGGE profile of 16S rDNA amplified products

3.4 驅替實驗前后稠油界面張力、粘度測定

3.4.1 驅替實驗前后界面張力變化

驅替實驗結束后, 將微生物驅油體系作用后的原油乳狀液破乳, 得到脫油水, 其界面張力見表3。從表可以看到, 與地層水樣和注入體系相比, 產出端樣品的界面張力分別下降 71.7%和 31.4%, 同時pH值也有所降低, 分別由地層水樣的7.2和注入體系的7.0降低到6.2, 這說明菌株在巖心內能夠繁殖,同時代謝過程中產生了表面活性物質和有機酸等物質, 結合 DGGE結果, 進一步說明稠油降解菌在表面活性劑的協助下, 利用加入的營養劑作用于稠油,產生表面活性物質和有機酸等降粘物質。

3.4.2 驅替實驗前后稠油粘度變化

表3 微生物作用前后界面張力及pH值變化Tab. 3 Interfacial tension and pH changes after microorganisms degradation

表4 微生物作用前后粘度變化Tab. 4 Viscosity changesafter microorganisms degradation

表4 微生物作用前后粘度變化Tab. 4 Viscosity changesafter microorganisms degradation

樣品號 粘度/(mPa·s) 降粘率/%模擬油(空白) 210.6 -非均質巖心2產出端乳狀液 47.5 77.4非均質巖心2產出端脫水油 155.1 26.4

驅替實驗結束后, 測定產出油水乳狀液粘度,然后對乳狀液進行破乳, 得到脫水油, 測定其粘度見表 4。由表 4可知, 模擬油在 55 ℃下的粘度為210.6 mPa·s, 產出乳狀液粘度為47.5 mPa·s, 經過微生物體系作用后的脫水油粘度為155.1 mPa·s。說明微生物作用稠油主要機理有二： 一為產生表面活性物質, 乳化稠油; 二為降解稠油中的膠質、瀝青質等烴重質組分, 改變原油品質, 降低原油粘度, 使其在后續水驅過程中更易流動, 這其中稠油乳化是主要機理, 同時稠油中重組分降解因其不可逆性也十分重要。

實驗最初擬將驅替實驗產出端原油進行四組分分析, 以進一步研究稠油降解菌對稠油的降解作用,但由于飽和用油為模擬油(柴油和稠油的混合體系),無法反應油藏的實際情況。

4 結論

本實驗結合 DGGE、原油粘度測定, 針對均質巖心、非均質巖心物理模擬驅油實驗中, 采油微生物對原油粘度和采收率的影響及其作用機理進行了研究, 結果顯示： 一方面, 微生物注入巖心后, 稠油粘度降低, 采收率明顯提高, 同時菌株濃度也相應升高, 說明采油微生物能夠利用巖心內稠油作為碳源生長, 其降解稠油和產生生物乳化劑作用對改善原油粘度和提高采收率具有顯著效果, 該驅油體系在稠油開發中具有一定的應用前景; 另一方面說明DGGE技術作為一種微生物生態結構、豐度的檢測手段, 具有快速、靈敏的特點, 結合現場實際條件,其應用對今后微生物采油中培養基優化、菌種篩選、配伍性研究、現場跟蹤監測具有重要指導意義。

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Analysis of bacterial communities in Bohai heavy oil degradation by 16S rDNA-PCR-DGGE

WANG Dawei1,2*, ZHANG Jian1,2, MA Ting3, LV Xin1,2, HE Chunbai1,2

1. State Key Laboratory of Offshore Oil Exploitation, Beijing 100028, China
2. China National Offshore Oil Corporation (CNOOC) Research Institute, Beijing 100028, China
3. Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology, Ministry of Education, College of Life Science, Nankai University, Tianjin 300071, China

Due to the reasons such as high viscosity of crude oil, quick increase of water, decrease of oil production, microbial enhanced oil recovery (MEOR) technology was used for improving heavy oil recovery in Bohai oil field. In this study, the recovery, moisture, pressure changes of homogeneous, non-homogeneous core flooding were studied by physical simulation experiments; structural and abundance changes of microbial communities were studied by denaturing gradient gel electrophoresis (Denature Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) technology; physical and chemical properties changes of crude oil were studied by oil viscosity measurement, and the mechanism of microbial enhanced heavy oil recovery was analyzed. Flooding simulation results showed that MEOR system could effectively enhance oil recovery, which could enhance oil recovery by 14.4% and 29.4%, respectively in homogeneous and non-homogeneous core flooding experiments; DGGE results showed that microbial system abundance of the outletend was significantly higher than that of injection end; crude oil viscosity measurement results showed that oil viscosity of the outlet end decreased. The results suggested that microorganisms could use heavy oil as carbon source, grow in the formation environment, reduce the viscosity of heavy oil and improve recovery, so that this technology has broad application prospects in Bohai heavy oil development .

heavy oil; microbial enhanced oil recovery; denature gradient gel electrophoresis; viscosity reduction; mechanism

10.14108/j.cnki.1008-8873.2016.01.019

TE122.14

A

1008-8873(2016)01-124-06

2015-01-23;

2015-11-03

十一五國家科技重大專項“海上油田化學驅油技術”(2011ZX05024-004)

王大威(1978—), 男, 2009年畢業于東北石油大學油氣田開發專業, 現任中海油研究總院采油工程師, 研究方向： 微生物采油等三次采油技術研究, E-mail： wangdw3@cnooc.com.cn

*通信作者：王大威, E-mail： wangdw3@cnooc.com.cn王大威, 張健, 馬挺, 等. 用PCR-DGGE方法分析渤海原油降解過程微生物群落結構變化[J]. 生態科學, 2016, 35(1)： 124-129. WANG Dawei, ZHANG Jian, MA Ting, et al. Analysis of bacterial communities in Bohai heavy oil degradation by 16S

rDNA-PCR-DGGE[J]. Ecological Science, 2016, 35(1)： 124-129.