新疆瑪納斯濕地土壤中真菌多樣性的初步研究

吳夢纖, 章芳, 王曉亮, 張亞平,*, 孫燕飛

石河子大學生命科學學院, 新疆, 石河子 832000

新疆瑪納斯濕地土壤中真菌多樣性的初步研究

吳夢纖1, 章芳1, 王曉亮1, 張亞平1,*, 孫燕飛1

石河子大學生命科學學院, 新疆, 石河子 832000

瑪納斯濕地土壤不同土層和不同地區中可培養真菌的篩選和分子鑒定, 對土壤總DNA的提取后進行PCR擴增后DGGE圖譜的分析來研究真菌的多樣性, 采用了DNA快速提取法、PCR—DGGE技術以及blast序列比對分析, 得到土壤中11種相似度較低的可培養真菌, 以及對不可培養真菌中22條不重復序列構建的系統發育樹?，敿{斯濕地土壤中真菌在不同季節數量有變化, 種類也存在一定的差異。不同樣地間同一季節真菌種類不同, 同一樣地不同土層間真菌種類也不是完全相同。不可培養真菌之間的差距要比可培養真菌之間的差距大。

土壤; 真菌; DGGE

1 引言

土壤真菌(soil fungi)[1]可以作為生態系統健康的指示物, 它分解有機質, 為植物提供養分, 其多樣性與土壤水分、有機質含量、植物多樣性呈正相關; 在土壤生態系統中, 真菌發揮著降解半纖維素等、還原氮、溶解磷、防治植物病害等重要功能。自然環境的真菌在氣候變化、環境污染和人類活動等多因素影響下, 其種類、數量、分布都發生了明顯變化。人們越來越重視對真菌多樣性的研究, 而研究一定區域內土壤真菌的多樣性將有助于我們了解該區域生態狀況和有益的微生物資源。

2 研究材料與研究方法

本文主要針對瑪納斯濕地微生物生態系統中的真菌的分布情況和類別進行研究分析。

目前對干旱區荒漠綠洲瑪河流域生態系統的微生物多樣性的系統研究, 依然處于空白階段?，敽恿饔颡毺氐牡乩砦恢靡约捌涮貏e的氣候環境, 有存在稀有微生物資源的可能, 同時也可以幫我們發現瑪河流域的微生物生態系統在維持綠洲生態平衡、涵養水源、儲藏微生物基因資源等方面的重要作用,因此值得對其進行研究。新疆瑪納斯濕地位于瑪納斯河流域、地處我國古爾班通古特沙漠南緣, 屬于干旱半干旱地區, 生態環境脆弱。但因為位于綠洲經濟帶腹地, 所以其生態位區就顯得極為重要。通過對瑪納斯濕地微生物的研究, 能對瑪河流域農業生產和經濟發展起到一定的促進作用。

真菌的分類鑒定是一項浩大的系統工程, 傳統的真菌分類學由于經常會得出假陽性或者假陰性的結果, 為準確鑒定真菌的類別造成了一定的難度?，F代分子生物學技術中, 利用PCR技術擴增真菌核糖體 ITS(Internal Transcribed Spacer)基因區段進行真菌鑒定的方法得到了迅速的發展。

2.1 研究區概況

本研究區新疆瑪納斯河國家濕地公園規劃區中部有三大蓄水水庫, 并有小型水庫、魚塘、沼澤、蘆葦灘溝通水系。樣地位于亞洲大陸腹地經緯度為43°03—46°03' N,84°48'—86°42' E, 屬干旱半干旱溫帶大陸型氣候, 干旱少雨, 日照充足, 熱量豐富, 四季分明, 冬季嚴寒, 春季酷熱等是其主要特征。樣地的年平均氣溫為6.8—7.1℃, 年平均日照為2886 h,年平均降水量205.7 mm, 年平均蒸發量1648.4 mm,相當于降水量的4—11倍。樣地海拔約350—650 m,土壤類型： 灰漠土、潮土、鹽土、平原林土、草甸土、沼澤土。濕地內生長有沼澤植物、草甸植物和鹽生植物等多種植物(其中藥用植物50多種), 生活著大量水生、陸生動物(Ⅰ、Ⅱ級保護動約15種), 是世界候鳥遷徙 3號路線的重要遷徙停歇地、繁殖地[2], 微生物資源豐富、代謝類型多樣。

圖1 真菌18S rDNA及ITS位置示意圖Fig. 1 Position of the annealing sites of fungal 18S rDNA and ITS primers used in this study

2.2 土樣采集

本次試驗于2013年進行采樣, 由于新疆的特殊氣候導致冬季持續時間較長, 土壤凍結程度較高,所以采集土壤時間為春季(5月), 一共分為鹽土、平原林土、潮土、沼澤土、草甸土以及人工種植土(葡萄園)6個采集樣點, 每個樣點分別采集1—10 cm、11—20 cm的土樣。采集時使用對角線法, 將同一樣點同一平面土壤混合后取對角線兩側土壤, 保存。

2.3 試驗方法與數據處理

2.3.1 菌種篩選

根據土壤真菌對營養需求的不同, 要采用不同成分的培養基進行培養篩選, 通常培養真菌主要使用馬丁氏培養基(孟加拉紅培養基)、馬鈴薯瓊脂培養基、麥芽浸汁瓊脂培養、松膏培養基等等, 其中最為常用的真菌分離和計數培養基是馬丁氏培養基和馬鈴薯培養基。本次試驗選擇培養基馬鈴薯培養基和馬丁氏培養基并充分培養以獲得更多的種類和數量, 同時用馬丁氏培養基分離單菌落用于菌種鑒定。

具體試驗方法為： 將5 g土樣于45 mL蒸餾水中進行震蕩混勻30 min, 然后靜置10 min后, 上清液為10-1倍的土壤菌懸液, 取1 mL稀釋至10-2倍, 再取1 mL 10-2倍菌懸液稀釋至10-3倍, 再將制好的已滅菌(1×105Pa滅菌30 min)培養基放涼至60℃左右,加入鏈霉素。采用混板法倒板, 培養真菌, 分離培養皿中的單菌落于馬鈴薯培養基中。

2.3.2 DNA快速提取法提取真菌DNA

將分離出的單菌落于液體馬鈴薯培養基中搖菌3天后12000 rpm離心10 min收集菌體, 加入少量石英砂后按1∶1加入DNA快速抽提buffer和酚氯仿,搖床搖菌1.5 h, 12000 rpm離心10 min收集上清液,加入1/10的3 M醋酸鈉混勻后, 在液體中加入等體積的異丙醇室溫靜置40 min, 12000 rpm離心10 min,棄上清, 使用70%乙醇洗滌后12000 rpm離心10 min,再用100%乙醇洗滌一次, 12000 rpm離心10 min后倒掉清液, 將EP管于超凈工作臺中吹干, 確認無乙醇殘留后加入適量TE溶液溶解DNA得到DNA溶液。

2.3.3 PCR擴增產物的連接轉化測序

用引物EF4、ITS4進行PCR擴增得到2000 bp左右真菌 18S DNA ITS區擴增片段, 雙酶切(hhaI/ ffa1)篩選后, 將得到的PCR產物純化后進行連接轉化, 再測序鑒定種屬。

本試驗測序均為上海生工測序, 使用 Excel 2013對數據進行編輯整理, 用Blast進行序列比對。

2.3.4 土壤總DNA的提取

土壤總DNA的提取采用天澤基因 DNAout 試劑盒提取。

2.3.5 PCR—DGGE

用含GC夾的引物ITS1和ITS2對土壤總DNA進行PCR擴增, 得到340 bp左右的真菌ITS區基因片段進行DGGE。對DGGE得到的電泳圖譜進行圖像處理, 同時對較明顯條帶進行切膠回收后使用不含GC夾的引物ITS1和ITS2再次進行PCR, 將得到的產物連接轉化后測序。

本試驗測序均為上海生工測序, 使用 Excel 2013對數據進行編輯整理, 用Blast進行比對。3 研究結果

3.1 真菌種屬鑒定

采集樣地A點位于新戶坪水庫, B點位于小海子水庫, C點位于下橋子三村水庫。

本次試驗采取6個樣地的土壤A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、B2-1、B2-2、C1-1、C1-2、C2-1、C2-2、CK1、CK2,共有12個土樣。分別代表著6種不同土壤類型條件下兩個土層四個季節的真菌種群變化。通過加入不同梯度濃度土壤懸浮液的馬鈴薯培養基中挑取單菌落在馬丁氏培養基中進行培養, 共分離出明顯不同的單菌落84株。

對84株真菌進行DNA提取后再進行PCR, 所得產物進行雙酶切處理, 得到不同DNA條帶所對應的菌株后連接轉化測序, 所得序列片段通過 NCBI進行Blast分析, 得到11種相似度較低的菌種, 分別為粗糙脈孢霉(Neurospora crassa); 斜臥青霉(Penicillium decumbens); 青霉菌(Penicillium); 肉座菌科(Hypocreaceae); 金龜子綠僵菌(Metarhizium);枝頂孢屬(Acremonium); 被孢霉屬(Mortierella); 產紫青霉(Penicillium purpurogenum); 枯萎病菌(Fusarium solani); 產黃青霉菌(Penicillium chrysogenum);擴展青霉(Penicillium expansum)。[5]

用轉化所得克隆體進行測序, 得到結果進行blast比對。

3.2 DGGE圖譜分析

通過 ITS區通用引物 ITS1和 ITS2對土壤總DNA進行含 GC夾的 PCR, 將得到的產物進行DGGE處理, 使用掃描成像儀拍攝電泳圖譜。

將DGGE圖譜使用Quantity One軟件進行處理,得到的處理數據導入Excel 2003, 應用Shannon指數計算 DGGE條帶豐度, 得到的結果如表 2所示。Shannon—Wiener index( H)計算方法采用羅海峰等的方法[12]。

通過對PCR—DGGE圖譜進行條帶切割后的膠回收, 得到約340 bp的DNA片段。膠回收后進行使用不含GC夾ITS1和ITS2引物的PCR反應得出的PCR產物進行連接轉化測序反應, 得到的序列使用MEGA6.0軟件進行系統發育樹分析。

表1 瑪納斯濕地春季(5月)可培養真菌鑒定Tab. 1 The culturable fungi identification from Manas Wetland in May

表2 瑪納斯濕地春季(5月)不同區域土壤中真菌DGGE圖譜條帶數和多樣性Tab. 2 DGGE band number and Shannon index of fungi communities in soil from different area in Manas Wetland in May

圖2 瑪納斯濕地春季(5月)土壤真菌ITS區PCR—DGGE圖譜Fig. 2 The ITS area PCR-DGGE picture of fungi on Manas Wetland in May

4 結論

根據表 1顯示數據, 我們得到瑪納斯濕地可培養真菌包含11種菌屬, 其中也包含了同屬不同種的菌群。這些菌種中青霉菌屬的種類遠大于其他種屬菌群含量, 這說明了瑪納斯濕地由于其土壤中水含量較高, 較適于青霉菌屬生長?？菸【某霈F則證明了瑪納斯濕地中植被存在枯萎病現象, 需求展開對枯萎病的防治工作。

由圖2顯示的瑪納斯濕地5月份土壤根際真菌DGGE圖譜, 向我們直觀展示了瑪納斯濕地春季(新疆春季較晚)土壤中真菌的含量。由圖我們可以看出瑪納斯濕地中葡萄田土壤(即 CK土壤)中真菌密度明顯大于天然濕地的土壤, 而新戶坪水庫土壤中真菌的含量明顯高于小海子水庫, 下橋子三村水庫的蘆葦根際土壤中真菌含量最低, 豐度也遠遠不如新戶坪水庫的真菌含量高。

表2則展示了不同區域中真菌含量和豐度的具體特性。在這幾處樣地中, 每個樣地的1—10 cm土壤中真菌DGGE的條帶數基本都大于11—20 cm土壤中的。每個樣地兩個土層的土壤中真菌多樣性的指數都相似, 1—10 cm的土壤真菌多樣性指數大部分小于11—20 cm土壤。

DGGE圖譜所不能直觀展示的瑪納斯濕地不可培養真菌間的親緣關系, 在系統發育樹(圖3)中得到了體現。在圖中可以看到不同樣地中含有的不可培養真菌之間存在共通性, 親緣關系較近。

瑪納斯濕地土壤中真菌的種類較其他自然環境土壤中真菌多一些, 但不如農田的土壤中真菌含量多, 這說明農田土壤由于經常翻起、澆水等人為因素可以使真菌的繁育更加容易, 同時種類也會更多。而由于地下水資源的流通, 土壤中真菌資源得以傳播和交流。瑪納斯濕地較多的降雨量和水資源儲備, 給真菌的流通創造了便利的條件, 致使三個水庫中真菌資源有一定程度的共享。同時豐富的水資源也為人工種植各種農作物創造了便利的條件。

本次試驗中所發現的枯萎病菌的存在在一定程度上會威脅到瑪納斯濕地農作物的生長, 希望能夠得到瑪納斯濕地地區附近農業產業的重視。

本文所寫出的僅僅是瑪納斯濕地土壤真菌資源中極少的一部分, 并不涉及落葉凋零物上的真菌。因所使用的分離方法和培養基的不同, 分離出的真菌種類也有很大差異。要對整個瑪納斯濕地豐富的土壤真菌資源進行全面準確地調查和鑒定, 需要多種不同的取樣方法、取樣時間和分離方法。整個瑪納斯濕地豐富的土壤真菌資源有待進一步調查,, 尤其是該地區特殊的自然環境條件、人為生態環境條件下, 植物內生真菌以及植物凋零物上豐富的真菌多樣性和生態學意義的研究, 這對新疆的“退耕還濕地”和農墾開發將具有極其重要的意義。

圖3 瑪納斯濕地春季(5月)DGGE測序真菌系統發育樹的構建Fig. 3 The DGGE phylogenetic tree of fungi in Manas Wetland in May

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The soil fungal diversity in Manas Wetand in Xinjiang

WU Mengxian1, ZHANG Fang1, WANG Xiaoliang1, ZHANG Yaping1,*, SUN Yanfei1The College of Life Ccience of Shihezi University, Shihezi 832000, China

In this paper, the fungi of different region and different soil layers in Manas Wetland were screened, and the soil fungal diversity was studied by method of DNA fast extraction, and PCR-DGGE technology and blast sequence analysis. 11 culturable strains and 22 unculturable strains were obtained, and similarity of 11 culturable strains was low. Phylogenetic tree of 22 unculturable strains was built. Overall, the numbers and the variety of fungi were different among seasons; variety of fungi was different among sampling plots in the same season, and among soil layers in the same sampling plots. The difference among unculturable strains was bigger than culturable strains.

soil; fungus; DGGE

10.14108/j.cnki.1008-8873.2016.01.020

Q

A

1008-8873(2016)01-130-06

2015-01-26;

2015-03-06

吳夢纖(1990—), 女, 新疆克拉瑪依人, 在讀研究生學位, 從事土壤微生物研究, E-mail： wmq0915@qq.com*通信作者：張亞平, 女, 博士, 教授, 主要從事微生物學研究, E-mail： 510224419@qq.com

吳夢纖, 章芳, 王曉亮, 等. 新疆瑪納斯濕地土壤中真菌多樣性的初步研究[J]. 生態科學, 2016, 35(1)： 130-135.

WU Mengxian, ZHANG Fang, WANG Xiaoliang, et al. The soil fungal diversity in Manas Wetand in Xinjiang[J]. Ecological Science, 2016, 35(1)： 130-135.