痛瀉要方對腸易激綜合征模型大鼠腸道高敏感性及海馬區c-Fos表達的影響*

安榮韓佩玉徐秋穎丁維俊孔維

成都中醫藥大學(成都 610075)

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痛瀉要方對腸易激綜合征模型大鼠腸道高敏感性及海馬區c-Fos表達的影響*

安榮▲韓佩玉△◇徐秋穎丁維俊孔維◆

成都中醫藥大學(成都 610075)

摘要目的：觀察痛瀉要方對腸易激綜合征模型大鼠結腸運動及海馬區c-Fos表達的影響，探討c-Fos在IBS發病中的作用機制。方法：采用慢性輕度不可預見性應激聯合高糖高脂飼料、高溫高濕環境加酒精刺激，建立IBS大鼠模型，應用痛瀉要方干預，雙歧桿菌作為陽性藥物對照。觀察大鼠一般情況、體重、腸道敏感性變化，連續治療3周后,采用免疫組化法檢測海馬區c-Fos表達情況。結果：與正常組比較，IBS模型組大鼠精神萎靡，體重明顯降低、腸道敏感性升高、海馬區c-Fos陽性細胞率增加(P<0.01)。與模型組比較，痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠精神好轉、體重增加、腸道敏感性降低，海馬區c-Fos陽性細胞率降低(P<0.05或P<0.01)。兩治療組比較無顯著差異。結論：c-Fos的表達與IBS的內臟敏感性有一定的聯系，痛瀉要方可能通過調節中樞c-Fos表達，從而改善腸道高敏感性，治療IBS。

主題詞腸易激綜合征/中醫藥療法 痛瀉要方/治療應用 體重變化 @c-Fos 動物實驗 大鼠

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome, IBS)是一種持續或間歇發作的腹痛、腹脹、排便行為和大便性狀異常，而缺乏胃腸道結構改變和生化異常依據的慢性腸道功能紊亂性疾病。我國IBS發病率為5%～12%[1]，歐美地區據報道為10%～20%[2-4]。其發病原因復雜，可能與胃腸道動力障礙、內臟感覺過敏、腦腸軸紊亂、腸道菌群失調、腸道炎癥和免疫反應、精神心理因素、遺傳等多種因素有關。其中內臟感覺過敏作為IBS重要病因和病理生理特征之一，被認為是腹部不適感覺的主要機制，可能是由內臟感覺通路異常或腦腸軸調節紊亂造成的。腦腸肽c-Fos作為神經元激活的標志物，在IBS的發病中起著重要作用。中藥復方痛瀉要方由炒白術、炒白芍、防風、陳皮四味中藥配伍而成，具有補脾柔肝，祛濕止瀉等功效，適用于IBS。本實驗采用慢性輕度不可預見性應激聯合高糖高脂飼料、高溫高濕環境加酒精刺激，建立IBS大鼠模型，應用痛瀉要方干預，觀察各組大鼠結腸運動功能各項指標及海馬區c-Fos表達情況，初步探討其可能作用機制。

1實驗材料1.1動物8周齡SPF級SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠40只，體重180～210g，購于成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(川)2013-24。飼養于成都中醫藥大學十二橋校區中醫眼科實驗中心動物房獨立換氣系統籠具(IVC)，每籠5只，每3d更換墊料，清洗、消毒籠具。室溫22～27℃，濕度50～70%，晝夜節律控制為12/12h(8:00開燈，20:00關燈)。

1.2藥物與試劑中藥痛瀉要方免煎顆粒江陰天江藥業有限公司生產，組成如下：炒白術3g/袋，相當飲片10g，批號1401089；炒白芍1g/袋，相當飲片10g，批號1312078；防風1g/袋，相當飲片6g，批號1401089；陳皮1g/袋，相當飲片6g，批號1401089，臨用前將以上四種藥各取1袋混合，以6g∶12mL蒸餾水溶解充分予以灌胃。雙歧桿菌活菌膠囊購于四川大藥房，由麗珠醫藥生產(麗珠腸樂)，每粒含0.5億活菌，批號20131135，4℃ 冰箱中保存備用。臨用前每粒以10mL蒸餾水混勻予以灌胃。兔抗大鼠c-Fos多克隆抗體(一抗)，編號ab53036，abcam公司生產。免疫組化染色試劑盒SP-9001，北京中杉金橋生產。

1.3主要儀器8Fr(3mm)雙腔兒童型末端帶氣囊導尿管，Leica EG 1160包埋機，Leica RM 2245輪轉式切片機，Leica HI 1220 烘片機，OlympusBX51光學顯微鏡。

2實驗方法2.1動物分組普通飼料適應性飼養1周，按照體重隨機將40只SD大鼠分為正常對照(N)組、模型對照(M)組、痛瀉要方(T)組、雙歧桿菌(B)組，每組10只。

2.2IBS模型建立IBC正常對照組以普通飼料喂養，其余各組完成兩方面造模： 脾胃濕熱泄瀉造模：以高糖高脂飼料喂養。造模第8天將大鼠每天放入自制造模箱高溫高濕環境(溫度32±2℃，相對濕度90±5%)2h。從第15天開始灌胃紅星二鍋頭(酒精度56%)，劑量7mL/kg，1次/d，共7d。 慢性輕度不可預見性應激造模：隨機給予①禁食24h；②禁水24h；③45℃環境5min；④夾尾1min：用止血鉗夾住距離尾尖1cm處，力度使動物發出哀叫聲即可，持續1 min；⑤4℃冰水游泳3min；⑥12h～12h晝夜顛倒；⑦水平振蕩(150次/min)45 min。每日隨機給予大鼠以上刺激的1種處理，每7d為1個周期，且任何連續2d的刺激均不相同，使大鼠不能預見發生何種刺激，共持續3周。

2.3給藥及方法T組給予痛瀉要方顆粒混懸液4mL/kg·d灌胃；B組給予雙歧桿菌混懸液5×106CFU/mL以4mL/kg·d灌胃；N組、M組均給予生理鹽水4mL/kg·d灌胃。連續3周。

2.4指標測定2.4.1體重測定：每周測定體重1次。

2.4.2痛閾測定：分別于造模前、造模后、干預后測定，大鼠禁食不禁水12 h，乙醚麻醉后，將8Fr(3mL)雙腔兒童型末端帶氣囊導尿管外涂石蠟油后插入肛門，使氣囊近端距肛門1 cm。將肛門外導尿管用膠帶從鼠尾近端開始固定，每隔2 cm處同樣方法固定，導管與注射器相連。將大鼠固定于透明塑料盒中，使其不能前后移動、翻轉，待大鼠蘇醒適應環境后, 注射器慢慢向球囊內注入常溫水擴張，觀察腹部收縮反射(Abdominal withdrawal reflex,AWR)，記錄引起大鼠腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面時的最小注水量，重復擴張 3 次, 每次間隔 5 min, 取3 次擴張測得的最小注水量的均值代表痛閾，評價大鼠對直腸內擴張刺激的敏感性。

2.4.3免疫組化法測定海馬區c-Fos表達：以10%水合氯醛30mL/kg行腹腔注射麻醉，開胸分別以生理鹽水、10%的甲醛經心臟灌洗后，迅速取出大腦，放入10%的甲醛中固定。取視交叉后4mm處至小腦前的腦組織常規石蠟包埋，4μm厚度切片，貼附于涂有多聚賴氨酸的玻片備用。采用免疫組化鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶(S-P)法測定大鼠大腦海馬區c-Fos表達。光鏡下以細胞內出現黃色、棕色、棕褐色顆粒為c-Fos陽性表達。觀察c-Fos免疫組化染色細胞陽性率，在200倍視野下選擇海馬同一區域記錄染色陽性細胞數，取其平均數。

3實驗結果3.1一般情況整個實驗期間，無大鼠死亡現象。正常對照組大鼠反應靈敏，精神狀態良好，飲食、大便正常，毛發順滑有光澤，造模后各組大鼠精神萎靡，易激惹，弓背，倦怠蜷臥，反應遲鈍，活動減少，食欲減低，出現不同程度稀便，體重增長緩慢或略有下降，毛發發黃、污穢、缺少光澤，肛周夾有粘液或體毛被稀便沾染。經藥物治療后各組大鼠上述表現均較模型組有明顯好轉。

3.2痛瀉要方對IBS大鼠體重的影響見表1。

大鼠實驗期間，正常對照組大鼠體重呈穩定的上升趨勢，而造模各組大鼠體重增長緩慢。與正常對照組比較，自造模第2周起，造模各組大鼠體重明顯開始低于正常組(P<0.01)，說明造模造成大鼠食欲減低，腹瀉出現導致體重增長緩慢。治療后，用藥組大鼠體重增長高于模型對照組，與模型對照組比較，自用藥2周起，痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠體重增長明顯高于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，說明痛瀉要方、雙歧桿菌治療IBS大鼠腹瀉效果明顯。痛瀉要方組與雙歧桿菌組比較，大鼠體重增長沒有明顯差異(P>0.05),說明兩者治療大鼠腹瀉效果相當。

表1　痛瀉要方對IBS大鼠體重的影響

注：與正常對照(N)組比較， ▲P<0.01；與模型對照組(T)比較，◇P<0.05，◆P<0.01

3.3痛瀉要方對IBS大鼠腸道痛閾的影響見表2。

造模后各組大鼠引起疼痛的直腸球囊最小注水量明顯低于正常對照組(P<0.01)，說明造模后大鼠腸道敏感性增高，痛閾降低。治療3周后，模型對照組、痛瀉要方組大鼠直腸球囊最小注水量明顯低于正常對照組(P<0.05或P<0.01)；與模型對照組比較，痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠直腸球囊最小注水量明顯增加(P<0.05或P<0.01)，說明其治療有助于降低腸道敏感性，痛閾升高；與雙歧桿菌組比較，痛瀉要方組大鼠直腸球囊最小注水量無明顯變化(P>0.05),說明兩者降低腸道敏感性效果相當。

表2　痛瀉要方對IBS大鼠腸道痛

注：與正常對照(N)組比較，△P<0.05, ▲P<0.01；與模型對照組(T)比較，◇P<0.05，◆P<0.01

3.4痛瀉要方對IBS大鼠海馬區c-Fos的影響見表3、圖1。治療3周后，與正常組對照比較，模型對照組、痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠海馬區c-Fos陽性細胞率均明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠海馬區c-Fos陽性細胞率均明顯降低(P<0.01)，說明兩者均有一定降低海馬區c-Fos陽性細胞率的作用；兩治療組比較，大鼠海馬區c-Fos陽性細胞率無明顯變化(P>0.05),說明兩者降低海馬區c-Fos表達的作用相當。

表3　痛瀉要方對IBS大鼠海馬區

注：與正常對照(N)組比較，?P<0.01；與模型對照組(T)比較，▲P<0.01

圖1　各組大鼠海馬區c-Fos陽性細胞表達情況

4討論中醫學將IBS歸為“腹痛”、“泄瀉”、“便秘”、“郁證”等范疇；認為本病由飲食不節、感受外邪、內傷七情、勞役稟賦等原因，導致肝脾失調，脾運失常，肝氣郁結，進而橫逆乘脾，致脾胃升降失調，氣機逆亂，出現腹痛、泄瀉等癥狀[5]。IBS主要證型有脾虛濕阻、肝郁脾虛、脾腎陽虛、脾胃濕熱、肝郁氣滯及腸道燥熱證[5-7]。肝郁脾虛是IBS核心病機，肝失疏泄是IBS 重要成因，脾胃升降失調是IBS發生的直接原因。痛瀉要方由白術、白芍、陳皮、防風組成，方中白術苦溫，補脾燥濕，為君藥；白芍酸寒，柔肝緩急止痛，與白術配伍，為臣藥；陳皮辛苦而溫，理氣燥濕，醒脾和胃，為佐藥；防風燥濕以助止瀉，為脾經引經藥，故為佐使藥。全方抓住IBS核心病機，適合于腹瀉型IBS,臨床療效良好。

西醫認為IBS病因復雜，但多數學者認為腦腸軸調控紊亂是IBS的重要病理基礎。而腦腸肽將腸神經和中樞神經聯系起來，調控腸道運動、感覺和內分泌功能，研究較多的腦腸肽包括5-羥色胺(5-HT)、血管活性腸肽(VIP)、膽囊收縮素(CCK)、P物質(SP)、c-Fos等，其中c-Fos是c-fos基因表達核蛋白，c-fos是即刻早期基因(Immediate early genes,IEGs)的一種表達蛋白，IEGs是在細胞受到刺激時最先表達的一組基因，c-fos的功能是通過c-Fos實現的，近年來作為神經元激活的標志物用于神經元通路的研究。研究表明，c-fos基因可被多種刺激如缺氧、疼痛刺激、機械刺激、慢性心理刺激、光線刺激等誘導在中樞海馬、大腦皮質、紋狀體快速表達，其中以海馬表達最為密集[8-12]，說明c-fos是調控心理應激反應和抗應激損傷的作用靶點之一。IBS因為內臟高敏感性引起的腹痛、腹瀉、腹脹等刺激，使中樞c-fos基因處于高表達狀態。研究表明[13]c-fos的表達與IBS的內臟敏感性和腸道運動有一定的聯系，腸神經叢初級感覺神經元的激活是IBS內臟高敏感的機制之一。

本實驗采用聯合造模方法建立脾胃濕熱泄瀉型IBS大鼠模型，免疫組化方法檢測各組大鼠海馬區c-Fos的陽性表達，結果顯示，模型組大鼠海馬區c-Fos的陽性細胞表達率較正常組顯著增高，說明脾胃濕熱泄瀉型IBS模型大鼠體內存在c-Fos水平升高的病理狀態，經治療后，痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠海馬區c-Fos較模型組顯著降低。同時本實驗檢測了各組大鼠腸道敏感性的變化，模型組較正常組痛閾明顯降低，腸道敏感性升高，經治療后，痛瀉要方組、雙歧桿菌組較模型組痛閾明顯升高，腸道敏感性降低。由此我們推測：應激反應誘導中樞c-fos表達量增加，產生的c-Fos升高可能使大鼠對應激的反應能力增強，通過腦-腸軸傳遞，引起腸道敏感性增高、胃腸運動亢進，從而產生腹痛、腹瀉、腹脹等腸道癥狀，痛瀉要方可能通過降低中樞c-fos基因的表達從而產生治療腹瀉型IBS的作用。

參考文獻

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(收稿2016-01-09；修回2016-02-13)

【中圖分類號】R259

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.05.046

*國家自然科學基金資助項目(81303087)

▲陜西中醫藥大學(咸陽 712046)

◇西南民族大學(成都 610041)

◆陜西省咸陽市第一人民醫院(咸陽712000)

△通訊作者

·實驗研究·