應用SNP標記高效鑒定黃瓜雜交種純度

姚丹青，朱文瑩，張微微，樓堅鋒，潘俊松

(1.上海市種子管理總站，上海　201103；2.上海交通大學，上海　200240；3.上海農林職業技術學校，上海　201699)

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應用SNP標記高效鑒定黃瓜雜交種純度

姚丹青1，朱文瑩2，張微微3，樓堅鋒1，潘俊松2

(1.上海市種子管理總站，上海201103；2.上海交通大學，上海200240；3.上海農林職業技術學校，上海201699)

摘要以71個市售黃瓜品種為材料，應用高分辨率熔解曲線技術篩選可用于黃瓜純度檢驗和品種鑒定的SNP位點，并通過焦磷酸測序驗證，得到14個SNP位點，這些位點在71個市售黃瓜品種中的多態信息量為0.079～0.528。為確保結果的準確性，利用該鑒定方法檢測黃瓜雜交種F1的94粒種子，結果顯示，Chr0108等6個SNP位點檢測的種子純度均為100%，且鑒定結果與SSR標記檢測方法相符。表明，對供試樣品同時進行這6個SNP位點的檢測分析，能夠更加可靠、準確、高效地鑒定其純度，并可用于DUS測試分析，為今后葫蘆科作物的品種審定和新品種保護等工作奠定基礎。

關鍵詞黃瓜；種子純度；SNP標記；高分辨率熔解曲線；焦磷酸測序

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)，是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，主要有密度高、遺傳穩定性好、具有代表性、分析易自動化等特性，已成為繼SSR之后的第3代分子標記，近年來被廣泛應用于蔬菜分子輔助育種及品種鑒定。Jung 等[1]利用Allele Specific PCR(AS-PCR)方法從COSⅡ (conserved ortholog setⅡ) 標記中篩選出40個辣椒SNP位點，能完全鑒定17個甜椒品種和81個辣椒品種中的79個。趙婷婷[2]利用SNP標記技術篩選出基因 Cf-9的單堿基突變位點，獲得含有番茄抗葉霉病基因 Cf-9的番茄材料，為培育新抗病品種提供物質基礎。宋偉等[3]根據多態性水平、染色體位置等信息從公共數據庫中篩選了48個玉米核心SNP位點，并通過基因分型分析，找到42個可以用來鑒別105份自交系材料的SNP位點。在葫蘆科作物中，Wim 等[4]從甜瓜公共EST數據庫發掘獲得45個SNP位點，豐富了甜瓜基因遺傳圖譜，并結合SNP標記和焦磷酸測序技術用于甜瓜品種鑒定。蘭青闊等[5]建立了基于CLA6位點(A/G)的黃瓜雜交種純度鑒定方法，并用該方法檢測出黃瓜雜交種‘優一’種子的純度。李歐靜等[6]分析了SNP位點CLA13 (C/G)在16個黃瓜育種材料中的多態性，建立了3 Pooling SNP Pyrosequencing檢測分析模型。

目前，已報道的SNP檢測和標記開發技術有許多種，如基于構象改變的SSCP、DGGE、DHPLC等,基于雜交的TaqMan、microarray等，以及基于引物延伸的DNA測序如焦磷酸測序等[7]。盡管方法眾多，但分別存在開發通量低、操作繁瑣、費用高、適用范圍有限等問題，限制了SNP標記在非模式生物中的開發和利用。近年來，高分辨率熔解曲線(high resolution melting，HRM)被證明是一種通量大、效率高的SNP檢測技術[8]，其原理是基于不同等位形式對退火溫度Tm的影響，通過熔解曲線的變化確定基因型。另外，可應用非標記探針進行HRM檢測，從而大幅降低SNP標記開發成本[9]。焦磷酸測序技術是實時、定量分析DNA序列的新一代測序技術，是基于引物引導的多聚酶延伸下的核酸合成的新型DNA測序技術[10]，具有操作簡單、結果準確和自動化程度高等優點，特別適合SNP等段序列分析，具有較高的靈敏性和準確性，可用于SNP分型分析。本研究利用HRM技術篩選黃瓜SNP位點，結合焦磷酸測序技術進行SNP分型驗證，為建立基于SNP標記的黃瓜雜交種純度檢測和品種鑒定技術奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

選用71個黃瓜雜交品種為試驗材料，其詳細特征見表1。

1.2DNA 提取

71個市售黃瓜品種每個品種取子葉，液氮冷凍研磨，加入CTAB 裂解緩沖液(20 g/L CTAB, 1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,20 mmol/L Na2EDTA)500 μL，65 ℃恒溫水浴裂解30 min，后續DNA提取純化按樹脂型基因組DNA提純試劑盒(北京塞百盛基因技術有限公司)操作進行。提取的DNA取1 μL 樣品于Nanodrop 2000 C微量分光光度計上進行DNA質量濃度檢測。DNA 提取后質量濃度統一稀釋至50 mg/L。

表1　市售黃瓜品種來源及特征特性

(續表1Continued table 1)

序號No.品種名稱 Cultivars品種類型 Type產地 Seedsource果皮顏色 Colour41碧豐二號Bifeng2華北型NorthChinatype遼寧Liaoning深綠Deepgreen42春秋碧翠Chunqiubicui華北型NorthChinatype遼寧Liaoning深綠Deepgreen43星雜二號Xingza2華北型NorthChinatype遼寧Liaoning深綠Deepgreen44粵豐園青瓜Yuefengyuancucumber華北型NorthChinatype廣東Guangdong深綠Deepgreen45種都三號Zhongdu3華北型NorthChinatype四川Sichuan深綠Deepgreen46世紀星溫室黃瓜Shijixinggreenhousecucumber華北型NorthChinatype遼寧Liaoning深綠Deepgreen4781138113華北型NorthChinatype山東Shandong綠Green48冬春二王子Dongchunerwangzi華北型NorthChinatype山東Shandong深綠Deepgreen49夏豐一號Xiafeng1華北型NorthChinatype山東Shandong深綠Deepgreen50早豐一號Zaofeng1華北型NorthChinatype遼寧Liaoning深綠Deepgreen51西興黃瓜2號Xixingcucumber2華南型SouthChinatype山東Shandong亮綠Brilliantgreen52深春Shenchun華南型SouthChinatype廣東Guangdong亮綠Brilliantgreen53申青一號Shenqing1華南型SouthChinatype上海Shanghai亮綠Brilliantgreen54富華二號Fuhua2日韓型JapanandSouthKoreatype山東Shandong亮綠Brilliantgreen5585F12華南型SouthChinatype山東Shandong亮綠Brilliantgreen56魯黃瓜三號Lucucumber3華南型SouthChinatype山東Shandong亮綠Brilliantgreen57綠衣天使Lüyitianshi華南型SouthChinatype山東Shandong翠綠Emerald58綠王Lüwang華南型SouthChinatype遼寧Liaoning亮綠Brilliantgreen59吉保Jibao華南型SouthChinatype山東Shandong深綠Deepgreen60萃斯五號Cuisi5華南型SouthChinatype遼寧Liaoning亮綠Brilliantgreen61南雜2號Nanza2華南型SouthChinatype上海Shanghai亮綠Brilliantgreen62寶雜2號Baoza2華南型SouthChinatype上海Shanghai亮綠Brilliantgreen63魯美一號Lumei1華南型SouthChinatype山東Shandong亮綠Brilliantgreen64珍寶大胡瓜Zhenbaocucumber加工型Processingtype廣東Guangdong墨綠Blackgreen65新萬吉青瓜Xinwanjicucumber加工型Processingtype廣東Guangdong墨綠Deepgreen66玉光迷你Yuguangmini歐洲溫室型Europeangreenhousetype北京Beijing綠色Green67碧玉二號Biyu2歐洲溫室型Europeangreenhousetype上海Shanghai碧綠Azuregreen68小泉一郎Xiaoquanyilang歐洲溫室型Europeangreenhousetype北京Beijing半白綠色Whiteandgreen69中農19號Zhongnong19歐洲溫室型Europeangreenhousetype北京Beijing亮綠Brilliantgreen70萃斯二號Cuisi2歐洲溫室型Europeangreenhousetype遼寧Liaoning亮綠Brilliantgreen71京海綠美Jinghailümei歐洲溫室型Europeangreenhousetype北京Beijing暗綠Sapgreen

1.3引物設計及合成

通過查詢NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、葫蘆科基因組網站(CuGenDB，http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi)數據庫獲得42個候選SNP位點，平均分布在黃瓜7條染色體上。HRM和焦磷酸測序引物使用軟件PyroMark Assay Design 2.0設計，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，上下游引物純化級別為HPLC，測序引物純化級別為ULTRAPAGE。

1.4高分辨率熔解曲線(HRM)檢測

HRM檢測在Qiagen real-time PCR system上進行。PCR擴增采用20 μL反應體系，其中10×Taqbuffer 2 μL，25 mmol/L Mg2+2.2 μL，10 mmol/L dNTP mix 0.6 μL，上下游引物(濃度為10 μmol/L)各0.2 μL，DNA 模板2 μL(質量濃度為90 mg/L)，5 U/ μLTaqPloymerase 0.4 μL，20×Evagreen(Biotium Corporation)1 μL，雙蒸水補足 20 μL。

反應程序為 95 ℃預變性5 min；35個循環反應(95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s)，降溫至65 ℃，并逐步上升至95 ℃。

1.5焦磷酸測序驗證

針對HRM篩選得到的SNP 位點，設計引物(PyroMark Assay Design 2.0軟件)，包括PCR 正向引物PCR-F、反向引物PCR-R 和測序引物Sequencing primer，用于制備測序反應模板的PCR擴增和焦磷酸測序反應，序列見表2。其中Biotin-為生物素標記修飾。引物來自上海生工生物工程技術服務有限公司，普通引物純化級別為HAP級，生物素標記引物純化級別為HPLC級，測序引物純化級別為ULTRAPAGE級。

表2　SNP位點類型及焦磷酸測序引物序列

PCR擴增采用50 μL反應體系，其中10×Taqbuffer 5 μL，25 mmol/L Mg2+5 μL，10 mmol/L dNTP mix 1 μL，上下游引物(濃度為10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板2 μL(質量濃度為90 mg/L)，5 U/μLTaqPloymerase 1 μL ，雙蒸水補足50 μL。

反應程序為94 ℃預變性5 min，50個循環反應(94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s)，72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。

焦磷酸測序反應在PyroMark ID 焦磷酸測序儀(Qiagen)上進行。配置Binding buffer(40 μL)和Sepharoe beads(2 μL)的Mix 80 μL體系，加入30 μL PCR產物，1 300 r/min渦旋混勻15 min，使得beads與生物素結合；經Vacuum prep workstation單鏈分離，釋放到預先加入38 μL Annealing buffer和2 μL測序引物(10 μmol/L)的PSQ 96測序反應板中，80 ℃金屬加熱塊(Labnet)上加熱2～5 min 后冷卻至室溫。將酶、底物和A、T、C、G成分加入試劑倉，即可上機測序。測序結果可通過分型分析模式(Genotyping)直接獲得樣品SNP類型。

1.6數據分析

對SNP位點的等位基因頻率、基因型頻率數據進行統計分析，多態信息量PIC值使用PIC_CALC 軟件計算。

1.7SSR標記純度檢測

PCR反應體系：1 ×TaqBuffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs，引物各 0.2 μmol/L， 模板 DNA 30 ng，0.5 UTaqDNA Polymerase，總反應體系為10 μL，其余用ddH2O補齊。引物序列為： SSR14268-F:AAAGCATGGAAGCAAAGCAC；SSR14268-R:ACAGAATGGACCAACGGAAT；SSR 01784-F:AGCACTGAGACGAATTATGCC；SSR 01784-R:AGTGCAGGCTTGTTGGTTCT。

擴增程序為:94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，33 個循環；72 ℃ 5 min。擴增產物在80 g/L 非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，電泳緩沖液為0. 5 ×TBE，250 V恒電壓電泳分離1.5 h，電泳后銀染顯色，統計帶型。

2結果與分析

2.142個候選位點HRM掃描分析

分別用42對引物對71個黃瓜品種試驗材料進行PCR擴增及HRM掃描分析。通過標準視圖(圖1-A)和差異視圖(圖1-B)顯示，71個黃瓜品種中含有候選SNP位點的3種變異類型。

圖1　Chr0303位點(左)和Chr0501位點(右)HRM分析結果

2.2焦磷酸測序技術檢測SNP位點

根據HRM掃描結果，對14個候選SNP位點的不同堿基變異類型進行PCR擴增和焦磷酸測序，確認SNP分型類型。測序結果顯示，不同SNP分型的堿基序列不同，與預期序列相符(圖2)，且結果與HRM篩選結果中變異類型分組相一致。

2.3SNP篩選群體分型結果

根據HRM分組結果及測序驗證結果，進行14個位點的SNP分型鑒定。對14個位點在71個市售黃瓜品種材料中的等位基因頻率、基因型頻率和多態信息量進行分析，結果顯示(表3)：Chr0303位點的PIC值高達0.528，處于高度多態；Chr0108、Chr0203、Chr0206、Chr0501、Chr0505和Chr0602位點的PIC值處于中度多態。

圖2　Chr0303位點(左)和Chr0501位點(右)焦磷酸測序驗證

位點Site等位基因頻率Allelefreq.類型Type頻率Frequency基因型頻率Genotypefreq.類型Type頻率Frequency多態信息量PIC群體分型Genotypeingroup雜交種Hybrid母本Maternalparent父本PaternalparentChr0102C76(0.543)C/C6(0.085)0.169C/TC/CC/TT64(0.457)C/T64(0.901)T/T1(0.014)Chr0108C98(0.721)C/C40(0.588)0.496C/TT/TC/CT38(0.279)C/T18(0.265)T/T10(0.147)Chr0203C19(0.134)C/C7(0.099)0.274C/TT/TT/TT123(0.866)C/T5(0.070)T/T59(0.831)

(續表3Continued table 3)

位點Site等位基因頻率Allelefreq.類型Type頻率Frequency基因型頻率Genotypefreq.類型Type頻率Frequency多態信息量PIC群體分型Genotypeingroup雜交種Hybrid母本Maternalparent父本PaternalparentChr0206C123(0.866)C/C57(0.803)0.307C/TT/TC/CT19(0.134)C/T9(0.127)T/T5(0.070)Chr0302C137(0.965)C/C66(0.930)0.122C/TC/CC/CT5(0.035)C/T5(0.070)T/T0Chr0303T96(0.676)T/T39(0.549)0.528T/CC/CT/TC46(0.324)T/C18(0.254)C/C14(0.197)Chr0407A4(0.028)G/G68(0.958)0.079A/GA/AG/GG138(0.972)A/G2(0.028)A/A1(0.014)Chr0408G121(0.852)G/G60(0.845)0.237G/AA/AG/GA21(0.148)G/A1(0.014)A/A10(0.141)Chr0501A118(0.831)A/A54(0.761)0.358A/CC/CA/AC24(0.169)A/C10(0.141)C/C7(0.099)Chr0505C35(0.273)T/T39(0.609)0.487C/TC/CT/TT93(0.727)C/T15(0.234)C/C10(0.156)Chr0602A103(0.725)A/A42(0.592)0.492A/GG/GA/AG39(0.275)A/G19(0.268)G/G10(0.141)Chr0608G134(0.944)G/G65(0.915)0.150G/TT/TG/GT8(0.056)G/T4(0.056)T/T2(0.028)Chr0701G9(0.065)G/G2(0.029)0.176G/AA/AA/AA129(0.935)G/A5(0.072)A/A62(0.899)Chr0706C133(0.937)C/C66(0.930)0.126C/TT/TC/CT9(0.063)C/T1(0.014)T/T4(0.056)

注:PIC>0.5 為高度多態, 0.25

Note：PIC >0.5, highly polymorphic; 0.25

2.4驗證可用于鑒定種子純度的SNP標記

以單粒黃瓜種子為檢測對象，進行萌發、DNA提取、PCR擴增及焦磷酸測序分型分析。如果分型結果為雜合型，則該粒種子為雜交種；如果為純合型，則該粒種子為來自親本的污染。供試品種的種子純度為雜合型種子數量占總測試種子的百分比[5]。 用于黃瓜雜交種種子純度鑒定的檢測樣品為上海交通大學黃瓜育種實驗室提供的母本S1000，父本S1002，以及94個雜交種種子DNA(圖3)。選取PIC值處于中度多態以上的7個SNP位點，篩查親本的分型情況，挑選父母本分型不同且均純合的SNP位點，最終篩選出6個SNP位點可用于黃瓜雜交種種子純度鑒定，分別為Chr0108、Chr0206、Chr0303、Chr0501、Chr0505和Chr0602。以上述6個位點為分析對象，進行焦磷酸測序分型分析,結果顯示，94株均為雜合型，計算該雜交一代的純度為100.0%(圖4)。同時，均以父母本為對照,得到6個SNP位點檢測結果一致。

圖3　黃瓜雜交種種子純度鑒定材料

H11為母本SNP分型H11 is the genotype of maternal parent；H12為父本SNP分型H12 is the genotype of paternal parent；其余為雜交種SNP分型Others are the genotype of hybrid

圖4 Chr0108位點(左)和Chr0602位點(右)群體驗證SNP分型

Fig.4The genotype results in group for Chr0108(left) and Chr0602 (right) SNP sites

為了證明結果的準確性，利用SSR標記檢測方法，從1號染色體和6號染色體上隨機選取SSR引物36對，篩選出8個多態性標記，利用多態性標記對供試雜交種父母本、雜交種種子純度進行鑒定，檢測結果(圖5)與SNP檢測結果一致，可以說明這6個SNP位點適用于該品種的純度鑒定。

圖為1號染色體上的SSR標記：SSR14268SSR marker on chr1,SSR14268；P1為母本S1000P1 as female parent S1000；P2為父本S1002P2 as male parent S1002

圖5 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測F1代種子純度電泳圖

Fig.5Polyacrylamide gel electrophoresis

for detecting F1seed purity

3討 論

隨著高通量測序技術的發展，大量的EST、SNP數據提交至相關數據庫。SNP標記作為第3代分子標記，具有其他標記技術無法比擬的優勢：分布密度高，SNP是目前為止分布最為廣泛、存在數量最多的一種多態性類型，其標記密度比SSR標記更高；與功能基因的關聯度高，更容易開發到性狀相關的SNP功能標記；遺傳穩定性強，SNP是基于單核苷酸的突變，其突變率低，一般僅為10-9，具有極高的遺傳穩定性；檢測通量高，易實現自動化分析。SNP標記一般只有2種等位基因型，數據統計簡單，且不依賴檢測平臺，容易實現不同來源數據的整合和標準化。因此，SNP 標記技術以其高密度及雙等位基因標記等特點已成為當前種子純度和品種鑒定的發展趨勢。

HRM 掃描分析以其快速、高通量、低成本的優勢成為當今SNP等堿基變異篩選分析的首選技術[11]。Wim 等[4]通過直接測序和數據庫(ICUGI)查詢方法篩選甜瓜EST-SNP標記，平均每412 bp中含有1個SNP，建立了葫蘆科作物中第1個包含SNP標記的遺傳圖譜，并以45個SNP位點對48個甜瓜品種進行區分。蘭青闊等[5]建立了基于CLA6位點的黃瓜雜交種純度鑒定方法，并用該方法檢測出黃瓜雜交種‘優一’種子的純度，該方法精確、快速、高通量且高度自動化，但是為確保結果的可靠性和準確性，應同時對供試樣品的多個SNP位點進行檢測分析。

本試驗通過測序比對和查詢NCBI、CuGenDB數據庫等方法從黃瓜7條染色體上獲得42個候選SNP 位點，利用新型的Qiagen real-time PCR system進行HRM 研究，在試驗中充分體現了HRM 技術快速、低成本、操作方便和閉管檢測防止污染等優勢。結合HRM掃描分析和Pyrosequencing分型分析，以71個市售黃瓜品種為材料，篩選出14個SNP檢測位點。為驗證SNP檢測位點的有效性和可行性，選取7個多態性較高的SNP位點為對象，以黃瓜雜交種種子的94份DNA和父母本DNA為模板，進行種子純度鑒定。結果顯示，基于6個SNP位點的Pyrosequencing檢測結果完全一致，純度都達到100%，初步可以說明其適用于該品種的純度檢測。為進一步鑒定結果的準確性，利用SSR標記對供試材料進行檢測，發現結果與SNP標記檢測結果一致。研究證明，對供試樣品的6個SNP位點同時進行檢測的黃瓜品種純度鑒定方法，更加準確和可靠，具備用于品種鑒定的潛能，為豐富黃瓜遺傳圖譜及相關功能基因研究奠定基礎。

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Received 2015-06-11Returned2015-08-10

Foundation item“12th Five-year Plan” National 863 Modern Agricultural Technology Projects (No. 2012AA100101); the Key Sci-tech Projects of Shanghai Municipal Science and Technology Commission (No.12391901500).

First authorYAO Danqing, female,master,agronomists.Research area:molecular plant breeding and seed quality inspection. E-mail:ydq_726@163.com

(責任編輯：潘學燕Responsible editor:PAN Xueyan)

Highly Efficient Identification of Seed Purity of Cucumber Hybrid by SNP Marker

YAO Danqing1, ZHU Wenying2, ZHANG Weiwei3, LOU Jianfeng1and PAN Junsong2

(1.Shanghai Seed Management Station，Shanghai201103，China； 2.School of Agriculture & Biology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai200240，China；3.Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry，Shanghai201699，China)

AbstractTo test the purity of hybrid of cucumber(Cucumis sativus L.), 14 SNP site was screened by high resolution melting(HRM) and pyrosequencing technology from 71 commercial cucumber cultivars, of which polymorphism information (PIC) were 0.079-0.528.To verify the accuracy of the results in purity test, 94 F1 hybrid seeds were screened and identified using 6 SNP markers. The result showed that the seed purity was 100%，which was consistent with the results identified by SSR method overall, 6 SNP markers for identification of purity in testing samples can be more reliable, accurate, and efficient method, and can be used in DUS testing, which laid the foundation of cucurbit crops variety examination and protection of new varieties for the future.

Key wordsCucumber；Seed purity；Single nucleotide polymorphism(SNP)；High resolution melting(HRM)；Pyrosequencing technology

收稿日期：2015-06-11修回日期：2015-08-10

基金項目：“十二五”國家863 現代農業技術領域項目(2012AA100101)；上海市科委重點科技攻關項目(12391901500)。

中圖分類號S642

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)04-0595-10

網絡出版日期：2016-04-02

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1118.032.html

第一作者：姚丹青，女，碩士研究生，農藝師，研究方向為分子植物育種與種子質量檢驗。E-mail:ydq_726@163.com