建立β3腎上腺素能受體過表達的心肌成纖維細胞模型方法的比較

張 源，王 麗，張 慧，馬依彤，楊毅寧，馬苗苗，朱曉麗

·論著·

建立β3腎上腺素能受體過表達的心肌成纖維細胞模型方法的比較

張 源，王 麗，張 慧，馬依彤，楊毅寧，馬苗苗，朱曉麗

【摘要】目的用兩種不同的方法構建β3腎上腺素能受體(β3-AR)過表達的SD乳鼠心肌成纖維細胞(CFBs)模型，并對兩種方法的效果進行比較，為今后在細胞水平觀察β3-AR對心功能，尤其是對慢性心力衰竭(CHF)的影響提供新的實驗方法。方法2015年3—6月，選取出生1～3 d的SFP級SD乳鼠8只。分離SD乳鼠CFBs并體外培養(yǎng)，隨機分為3個感染復數(shù)(MOI)組，分別為MOI 50組、MOI 100組、MOI 200組，采用β3-AR基因過表達的慢病毒載體感染CFBs，利用流式細胞儀檢測感染率，確定最佳MOI。將SD乳鼠CFBs隨機分為4個β3-AR激動劑干預組，分別為正常對照組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組，采用不同濃度β3-AR激動劑干預CFBs，利用Western blotting法檢測β3-AR表達水平，挑選出β3-AR激動劑干預CFBs的最適濃度。結果普通光學顯微鏡下觀察CFBs，無搏動性，大多數(shù)呈梭形，其細胞核較大，胞質(zhì)透明。倒置熒光顯微鏡下觀察感染24、48、72、96 h時CFBs狀態(tài)及熒光表達情況，感染72 h時，各MOI組CFBs生長狀態(tài)較好，細胞大多數(shù)呈梭形，無搏動性，細胞核較大，且肉眼觀察熒光表達最佳。MOI 100組、MOI 200組感染率高于MOI 50組(P<0.05)；MOI 200組感染率低于MOI 100組(P<0.05)。10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組β3-AR表達水平高于正常對照組(P<0.05)；10-5mol/L組β3-AR表達水平高于10-6mol/L組、10-4mol/L組(P<0.05)。10-5mol/L組、MOI 100組β3-AR表達水平高于正常對照組(P<0.05)；MOI 100組β3-AR表達水平高于10-5mol/L組(P<0.05)。結論使用β3-AR過表達的慢病毒載體感染CFBs與β3-AR激動劑干預CFBs均可使其β3-AR過表達，且前者效果優(yōu)于后者。

【關鍵詞】受體,腎上腺素能β3；成纖維細胞；心肌；慢病毒載體

張源，王麗，張慧，等.建立β3腎上腺素能受體過表達的心肌成纖維細胞模型方法的比較[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(15)：1774-1780.[www.chinagp.net]

Zhang Y,Wang L,Zhang H,et al.Comparison of two methods of building cardiac fibroblasts models with β3-AR overexpression[J].Chinese General Practice，2016，19(15)：1774-1780.

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是心血管疾病的最終轉歸，表現(xiàn)為復雜的心肌結構、表型和功能的變化，神經(jīng)體液的代償與失代償貫穿始終。而交感神經(jīng)系統(tǒng)是CHF過程中神經(jīng)體液調(diào)節(jié)的核心。近年來關于β3腎上腺素能受體(β3adrenergic receptor，β3-AR)的研究逐漸成為熱點[1]。以往研究認為，β3-AR主要分布于人體脂肪、腸道和肺組織，參與脂肪分解和能量代謝，與心臟關系不大[2]。β3-AR于1989年被成功克隆和鑒定后，學者發(fā)現(xiàn)其也廣泛分布于心臟及血管組織中[3]。有許多研究表明，CHF時β3-AR表達水平升高，促進心肌重構，惡化患者的心功能，但其具體機制尚未明確[4]。心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFBs)的增殖和纖維化是心肌重構的重要過程，且具有易培養(yǎng)、易生長等優(yōu)勢，因此其有潛在的基因治療靶細胞的特性。由于β3-AR在正常心肌組織中分布很少，不便于觀察與檢測，因此本研究通過兩種方法誘導CFBs中的β3-AR過表達，并對比其效果，便于今后在細胞水平觀察β3-AR對心功能的影響。

1材料與方法

1.1主要材料2015年3—6月，選取出生1～3 d的SPF級SD乳鼠8只，雌雄不限，由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供〔動物合格證號：SCXK(新)2011-0004〕。β3-AR過表達的慢病毒載體(含有綠色熒光蛋白)由賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司提供(慢病毒目的基因序列號：NM_013108.2)；β3-AR抗體(型號：M-20，Santa Cruz公司，日本)；β3-AR激動劑(型號：BRL37344，Sigma公司，美國)；胎牛血清、高糖達氏改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；雙抗、谷氨酰胺、D-Hanks、胰酶、牛血清清蛋白(BSA)(HyClone公司，美國)；Ⅱ型膠原酶(Worthington公司，美國)；膜蛋白提取試劑盒(Merck公司，德國)。

1.2研究方法

1.2.1CFBs的分離、培養(yǎng)及形態(tài)觀察取8只SD乳鼠，分別用溶于D-Hanks中的胰酶、Ⅱ型膠原酶依次消化分離心肌組織，通過2次差速貼壁法分離、收集并培養(yǎng)乳鼠CFBs，應用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，在普通光學顯微鏡下觀察CFBs形態(tài)。以后每隔2～3 d進行1次細胞傳代，傳至第2代的CFBs可用于實驗。

1.2.2CFBs感染實驗將CFBs傳至第2代，按1×106個/孔接種于6孔板內(nèi)，每孔加入高糖DMEM培養(yǎng)液1 ml培養(yǎng)48 h。隨機分為3個感染復數(shù)(multiply of infection，MOI)組，分別為MOI 50組、MOI 100組、MOI 200組，按照不同的MOI將β3-AR過表達的慢病毒載體加入培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每組設立2個平行復孔。分別于感染后24、48、72、96 h在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)及熒光表達情況。

1.2.3流式細胞儀檢測感染率觀察細胞狀態(tài)及熒光表達情況后選取不同MOI組最佳時間點CFBs，采用流式細胞儀檢測感染率，確定最佳MOI。將細胞用胰酶消化后，收集細胞懸液，1 000 r/min離心3 min(離心半徑8 cm)，4 ℃磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用4%多聚甲醛溶液室溫固定40 min，1 000 r/min離心5 min(離心半徑8 cm)，去上清液，最后用PBS重懸細胞，將細胞混勻成為單細胞懸液，每個樣品取200 μl單細胞懸液，將各組樣品放入流式細胞儀內(nèi)檢測，采用CELL Quest軟件分析感染率，確定最佳MOI(感染率最高的MOI)。實驗獨立重復3次。

1.2.4不同濃度β3-AR激動劑干預CFBs傳至第2代的CFBs培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)液換成不含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，使細胞保持在饑餓狀態(tài)，孵育24 h后，隨機分為4個β3-AR激動劑干預組，分別為正常對照組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組。10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組分別加入相應濃度β3-AR激動劑，正常對照組不進行干預處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于實驗檢測。

1.2.5Western blotting法檢測β3-AR表達水平按照膜蛋白提取試劑盒說明書提取感染率最高的MOI組及不同濃度β3-AR激動劑干預組CFBs膜蛋白，檢測蛋白濃度，每孔40 μg上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)后轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，BSA室溫封膜，加入β3-AR抗體、GAPDH抗體，4 ℃過夜。次日用0.05% TBST 洗膜，加入二抗孵育2 h，洗膜后采用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)法顯色，Bio-Rad成像分析系統(tǒng)掃描，Image Lab軟件分析灰度值，采用目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值(IOD)表示目的蛋白相對表達水平，即β3-AR表達水平。實驗獨立重復3次。挑選出β3-AR激動劑干預CFBs的最適濃度，并與正常對照組、感染率最高的MOI組β3-AR表達水平進行比較。

2結果

2.1CFBs形態(tài)普通光學顯微鏡下觀察CFBs，無搏動性，大多數(shù)呈梭形，其細胞核較大，胞質(zhì)透明(見圖1)。

圖1　普通光學顯微鏡下第2代心肌成纖維細胞(×200)

Figure1Thesecondgenerationofcardiacfibroblastsobservedunderordinaryopticsmicroscope

2.2CFBs狀態(tài)及熒光表達情況倒置熒光顯微鏡下觀察感染24、48、72、96 h時CFBs狀態(tài)及熒光表達情況：感染24 h時，各MOI組細胞較稀疏，部分形態(tài)還未完全變?yōu)樗笮危瑹晒獗磉_不顯著；感染48 h時，各MOI組熒光表達較感染24 h時有所增加，細胞大部分呈梭形；感染72 h時，各MOI組CFBs生長狀態(tài)較好，細胞大多數(shù)呈梭形，無搏動性，細胞核較大，且肉眼觀察熒光表達最佳；感染96 h時，各MOI組細胞密度降低，熒光表達不如感染72 h時，但較感染24 h和感染48 h時熒光表達增多(見圖2～5)。

2.3感染率比較MOI 50組、MOI 100組、MOI 200組均是感染72 h時感染率最高，分別為(34.80±0.03)%、(72.80±0.02)%、(44.10±0.03)%(見圖6)。3組感染率比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=1 605 122.73，P<0.001)；其中MOI 100組、MOI 200組感染率高于MOI 50組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MOI 200組感染率低于MOI 100組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4β3-AR表達水平比較

2.4.1不同濃度β3-AR激動劑干預組β3-AR表達水平比較4組β3-AR表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組β3-AR表達水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；10-5mol/L組β3-AR表達水平高于10-6mol/L組、10-4mol/L組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1、圖7)。

2.4.2正常對照組、10-5mol/L組、MOI 100組β3-AR表達水平比較3組β3-AR表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。10-5mol/L組、MOI 100組β3-AR表達水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MOI 100組β3-AR表達水平高于10-5mol/L組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2、圖8)。

Table1Comparisonoftheexpressionlevelofβ3-ARamongintenventiongroupsofdifferentconcentrationsofβ3-ARagonists

組別β3-AR正常對照組0.07±0.0110-6mol/L組0.20±0.01a10-5mol/L組0.25±0.02ab10-4mol/L組0.21±0.01acF值105.02P值<0.001

注：β3-AR=β3腎上腺素能受體；與正常對照組比較，aP<0.05；與10-6mol/L組比較，bP<0.05；與10-5mol/L組比較，cP<0.05

注：MOI=感染復數(shù)；A為熒光場，B為明光場

圖2各MOI組感染24 h時CFBs熒光表達情況(×200)

Figure 2Fluorescence expression of CFBs of each MOI group at 24 h after infection

注：A為熒光場，B為明光場

圖3各MOI組感染48 h時CFBs熒光表達情況(×200)

Figure 3Fluorescence expression of CFBs of each MOI group at 48 h after infection

注：A為熒光場，B為明光場

圖4各MOI組感染72 h時CFBs熒光表達情況(×200)

Figure 4Fluorescence expression of CFBs of each MOI group at 72 h after infection

注：A為熒光場，B為明光場

圖5各MOI 組感染96 h時CFBs熒光表達情況(×200)

Figure 5Fluorescence expression of CFBs of each MOI group at 96 h after infection

圖6　流式細胞儀檢測不同MOI組72 h時的感染率

注：從左至右分別為正常對照組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組

圖7不同濃度β3-AR激動劑干預組SDS-PAGE圖

Figure 7Sodium dodecyl sulfate polypropylene acyl ammonia gel electrophoresis figure of intervention groups of differnet concentrations of β3-AR agonists

Table 2Comparison of the expression level of β3-AR among normal control group,10-5mol/L group and MOI 100 group

組別β3-AR正常對照組0.05±0.0110-5mol/L組0.18±0.03aMOI100組0.81±0.03abF值736.71P值<0.001

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與10-5mol/L組比較，bP<0.05

注：從左至右分別為10-5mol/L組、MOI 100組、正常對照組

圖8正常對照組、10-5mol/L組、MOI 100組SDS-PAGE圖

Figure 8Sodium dodecyl sulfate polypropylene acyl ammonia gel electrophoresis figure of normal control group,10-5mol/L group and MOI 100 group

3討論

CHF過程中交感神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)激活，兒茶酚胺通過激活β1腎上腺素能受體(β1-AR)、β2腎上腺素能受體(β2-AR)、β3-AR介導其產(chǎn)生血管、心臟生物效應[5]。目前大多數(shù)研究認為，衰竭心肌組織中β3-AR表達水平升高，介導負性變力作用，惡化心功能[6-7]。還有研究認為，β3-AR激活后可促進心肌纖維化，介導心肌重構，參與CHF進展[8]。然而也有研究認為，β3-AR在CHF中起到保護作用[9]。由于樣本量、檢測方法、使用模型不同等原因，目前β3-AR對心功能的影響尚無明確定論，尚需要綜合性更強并且更深入的研究來明確。心臟由心肌細胞和非心肌細胞組成，非心肌細胞中90%以上由CFBs組成，其不僅對心肌細胞具有結構上的支持、保護作用，而且還具有自分泌和旁分泌功能，影響心肌細胞的結構和生理功能，在心臟間質(zhì)纖維化過程中也發(fā)揮著重要作用[10]。因此，誘導CFBs中β3-AR過表達對研究β3-AR在心功能，尤其是在CHF進展中的影響及機制是很有必要的。

目前有許多方法誘導細胞目的基因過表達，包括目的基因過表達載體感染、藥物干預等[11-12]。腺病毒和慢病毒是目前比較常用的病毒載體，腺病毒載體雖然感染率高，但是攜帶的目的基因不能整合至靶細胞基因組，表達時間短且不穩(wěn)定，而以HIV-1為基礎構建的新型慢病毒載體具有可感染非分裂細胞、目的基因整合至靶細胞基因組、長期穩(wěn)定表達、免疫反應小、細胞毒性小等優(yōu)點，是較為理想的基因轉移載體[13]。因此，本研究組選擇慢病毒感染使目的基因過表達，并對比其與藥物誘導目的基因過表達的效果。結果顯示，感染72 h時，各MOI組CFBs生長狀態(tài)較好，細胞大多數(shù)呈梭形，無搏動性，細胞核較大，且肉眼觀察熒光表達最佳；MOI 100組、MOI 200組感染率高于MOI 50組；MOI 200組感染率低于MOI 100組，提示MOI為100感染72 h是干預CFBs的最佳MOI；10-5mol/L組β3-AR表達水平高于10-6mol/L組、10-4mol/L組，提示10-5mol/L為β3-AR激動劑干預CFBs的最適濃度；10-5mol/L組、MOI 100組β3-AR表達水平高于正常對照組，提示慢病毒感染與β3-AR激動劑干預均能使CFBs中β3-AR過表達；MOI 100組β3-AR表達水平高于10-5mol/L組，提示慢病毒感染使CFBs中β3-AR過表達的效果優(yōu)于β3-AR激動劑干預，這可能與藥物對細胞內(nèi)環(huán)境的影響有關。

目前國內(nèi)外尚未見使用β3-AR過表達的慢病毒載體感染CFBs的實驗方法，本研究組首次嘗試使用攜帶β3-AR基因的慢病毒載體感染CFBs，在感染時間和處理方法上可能存在一些不確定因素，但本研究組在實驗中進行了多次重復實驗，盡可能將誤差降至最低，以保證實驗結果的真實性與可靠性。

綜上所述，使用β3-AR過表達的慢病毒載體感染CFBs與β3-AR激動劑干預CFBs均可使其β3-AR過表達，且前者效果優(yōu)于后者。CFBs β3-AR過表達模型的成功構建為今后在細胞水平觀察β3-AR對心功能的影響提供新的實驗方法，為臨床治療心力衰竭及心肌重構等提供了新思路、新方法，為進一步的研究提供相關的理論基礎。

作者貢獻：張源進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；張慧、馬依彤、楊毅寧、馬苗苗、朱曉麗進行實驗實施、評估、資料收集；王麗進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1]Bhadada SV,Patel BM,Mehta AA,et al.β(3) receptors:role in cardiometabolic disorders[J].Ther Adv Endocrinol Metab,2011,2(2):65-79.

[2]Michel MC,Harding SE,Bond RA.Are there functional β3-adrenoceptors in the human heart?[J].Br J Pharmacol,2011,162(4):817-822.

[3]Forrest RH,Hickford JG.Rapid communication:nucleotide sequences of the bovine,caprine and ovine beta3-adrenergic receptor genes[J].J Anim Sci,2000,78(5):1397-1398.

[4]胡小芳,李娜,王麗,等.β3腎上腺素能受體對慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響[J].臨床心血管病雜志,2015,31(4)：446-450.

[5]Sheng L,Shen Q,Huang K,et al.Upregulation of β3-adenergic receptors contributes to atrial structural remodeling in rapid pacing induced atrial fibrillation canines[J].Cell Physiol Biochem,2012,30(2):372-381.

[6]Zhao Q,Zeng F,Liu JB,et al.Upregulation of β3-adrenergic receptor expression in the atrium of rats with chronic heart failure[J].J Cardiovasc Pharmacol Ther,2013,18(2):133-137.

[7]Zhang YH,Casadei B.Sub-cellular targeting of constitutive NOS in health and disease[J].J Mol Cell Cardiol,2012,52(2):341-350.

[8]Chen Z,Miao G,Liu M,et al.Age-related up-regulation of beta3-adrenergic receptor in heart-failure rats[J].J Recept Signal Transduct Res,2010,30(4):227-233.

[9]Moens AL,Yang R,Watts VL,et al.Beta 3-adrenoreceptor regulation of nitric oxide in the cardiovascular system[J].J Mol Cell Cardiol,2010,48(6):1088-1095.

[10]Brown RD,Ambler SK,Mitchell MD,et al.The cardiac fibroblast:therapeutic target in myocardial remodeling and failure[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2005,45:657-687.

[11]Weng XS,Li LH,Qiu GX,et al.The comparation of transfection efficiency to New Zealand rabbit chondrocytes using enhanced green fluorescent protein in vitro[J].Chinese Journal of Orthopaedics,2008,28(5):408-412.(in Chinese)

翁習生,李連華,邱貴興,等.增強綠色熒光蛋白標記比較腺病毒、腺相關病毒體外轉染兔軟骨細胞的效果[J].中華骨科雜志,2008,28(5):408-412.

[12]Kong YH,Cao RY,Zhang L,et al.Effect of β3adrenergic receptor agonist and antagonist on expression of MMP-2 and MMP-9 in heart failure rat[J].Basic & Clinical Medicine,2010,30(11):1177-1183.(in Chinese)

孔一慧,曹榮元,張莉,等.β3腎上腺素能受體激動劑和抑制劑對心衰大鼠心室MMP-2和MMP-9表達的影響[J].基礎醫(yī)學與臨床,2010,30(11):1177-1183.

[13]Aldini L,Bl?mer U,Gallay P,et al.In vivo gene delivery and stable stransduction of nondividing cells by a lentiviral vector[J].Science,1996,272(5259):263-267.

(本文編輯：崔麗紅)

Comparison of Two Methods of Building Cardiac Fibroblasts Models With β3-AR Overexpression

ZHANGYuan,WANGLi,ZHANGHui,etal.

DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitaloftheMedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi832008,China

【Abstract】ObjectiveTo build neonatal SD rat cardiac fibroblasts(CFBs) models with β3-AR overexpression by two different methods and compare the two methods so as to provide new experimental method for exploring the effect of β3-AR on heart function,especially on chronic cardiac failure.MethodsFrom March to June in 2015,8 SPF neonatal SD rats born 1 to 3 days ago were selected.CFBs of the rats were cultured in vitro and were randomly divided into three MOI groups which were MOI 50 group,MOI 100 group and MOI 200 group.These CFBs were infected by lentiviral vector with β3-AR overexpression,and infection rate was detected by flow cytometry to determine the optimal MOI.CFBs were randomly divided into four β3-AR agonist intervention groups which were normal control group,10-6mol/L group,10-5mol/L group,and 10-4mol/L group.Intervention was conducted on these CFBs by different concentrations of β3-AR agonist,and β3-AR expression level was detected by Western blotting method to find out the optimal concentration of β3-AR agonist in the intervention on CFBs.ResultsObserved under normal optics microscope,CFBs showed no pulsation and mostly took on fusiform shape,with large cell nucleus and transparent cytoplasm.The status of CFBs and fluorescent expression were observed under inverted fluorescence microscope at 24,48,72 and 96 h after infection.At 72 h,CFBs of each MOI group were in good growth status,they were mostly in fusiform shape and had no pulsation,with large cell nucleus,and the fluorescent expression observed by naked eye was optimal.MOI 100 group and MOI 200 group were higher than MOI 50 group in infection rate(P<0.05);MOI 200 group was lower than MOI 100 group in infection rate(P<0.05).10-6mol/L group,10-5mol/L group and 10-4mol/L group were higher than normal control group in the expression level of β3-AR(P<0.05);10-5mol/L group was higher than 10-6mol/L group and 10-4mol/L group in the expression level of β3-AR(P<0.05).10-5mol/L group and MOI 100 group were higher than normal control group in the expression level of β3-AR(P<0.05);MOI 100 group was higher than 10-5mol/L group in the expression level of β3-AR(P<0.05).ConclusionTwo methods of lentiviral vector and β3-AR agonists are both able to induce the overexpression of β3-AR in CFBs.By comparison,the method of lentiviral vector infection is better.

【Key words】Receptors,adrenergic,beta-3;Fibroblasts;Myocardium;Lentiviral vecto

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81260028)；石河子大學科學技術研究發(fā)展計劃“自然科學與技術創(chuàng)新”團隊創(chuàng)新項目(2011ZRKXTD-07)

作者單位：832008 新疆石河子市，石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科(張源，王麗，張慧，馬苗苗，朱曉麗)；新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟中心(馬依彤，楊毅寧)

通信作者：王麗，832008 新疆石河子市，石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科；E-mail：mcmwl@163.com

【中圖分類號】R 542.2

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.15.008

(收稿日期：2015-10-13；修回日期：2016-03-11)