大黃與甘草合用對腸功能衰竭大鼠炎性因子的影響研究

徐 鑫，孟 檸，俞毅君，胡銘榮

·論著·

大黃與甘草合用對腸功能衰竭大鼠炎性因子的影響研究

徐 鑫，孟 檸，俞毅君，胡銘榮

310015浙江省杭州市，杭州師范大學附屬醫院普外科

【摘要】目的探討大黃與甘草合用對腸功能衰竭大鼠炎性因子的影響以及作用機制。方法按隨機、雙盲、平行對照試驗設計，2015年6—8月選取SFP級SD大鼠60只，采用隨機數字表法分成空白對照組、模型組、大黃組、甘草組、合用組、標準品組，每組10只。模型組、大黃組、甘草組、合用組、標準品組大鼠采用乙酸誘導形成腸功能衰竭模型。造模成功后，大黃組、甘草組、合用組大鼠分別給予5 g/kg大黃、甘草、大黃和甘草溶液灌胃；標準品組大鼠給予40 mg/kg大黃素和甘草酸標準品溶液灌胃；空白對照組和模型組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。7 d后，采用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察結腸組織形態變化。評價疾病活動指數(DAI)、大體形態損傷評分和組織學損傷評分，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測大鼠血清及結腸組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素(IL)-6 、IL-8 表達水平。結果與空白對照組比較，模型組、大黃組、甘草組、合用組、標準品組大鼠DAI、大體形態損傷評分及組織學損傷評分升高(P<0.05)；與模型組比較，大黃組、合用組、標準品組大鼠DAI、大體形態損傷評分及組織學損傷評分降低，甘草組大鼠DAI降低(P<0.05)；與大黃組比較，甘草組大鼠DAI、大體形態損傷評分及組織學損傷評分升高，合用組大鼠DAI及組織學損傷評分降低(P<0.05)；與甘草組比較，合用組、標準品組大鼠DAI、大體形態損傷評分及組織學損傷評分降低(P<0.05)；與合用組比較，標準品組大鼠DAI及組織學損傷評分升高(P<0.05)。與空白對照組比較，模型組、大黃組、甘草組、合用組、標準品組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，大黃組、甘草組、合用組、標準品組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平降低(P<0.05)。與空白對照組比較，模型組、大黃組、甘草組、合用組、標準品組大鼠結腸組織TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平升高(P<0.05)；與模型組和甘草組比較，大黃組、合用組、標準品組大鼠結腸組織TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平降低(P<0.05)。結論大黃與甘草合用對腸功能衰竭大鼠具有協同抗炎作用，其主要作用的物質基礎為大黃素和甘草酸。

【關鍵詞】腸功能衰竭；大黃；甘草；炎癥趨化因子類

徐鑫，孟檸，俞毅君，等.大黃與甘草合用對腸功能衰竭大鼠炎性因子的影響研究[J].中國全科醫學，2016，19(15)：1824-1827.[www.chinagp.net]

Xu X,Meng N,Yu YJ,et al.Effect of the combined use of rheum and liquorice on inflammatory factors in rats with intestinal function failure[J].Chinese General Practice，2016，19(15)：1824-1827.

腸功能衰竭簡稱腸衰竭，是指機體受到創傷、感染、失血、顱腦損傷等外界嚴重刺激時所表現出的強烈的應激反應，在機體的非特異性防御系統中起重要作用，因此腸道也被稱為應激器官的中心[1]。腸衰竭患者普遍喪失或者即將喪失自主營養性，腸道功能紊亂，從而出現腹脹、嘔吐、胃腸蠕動變緩甚至停止等臨床表現，而且一旦發生預后較差，增加臨床病死率。腸衰竭的防治研究已成為當前醫學領域中的一個重要研究課題[2]。現代醫學通過腸外營養、藥物治療、手術治療腸衰竭，存在一定局限性[3]。近年來中醫藥以其整體調節以及多靶點治療等優勢引起人們的注意，使中醫藥在治療腸衰竭領域中有了廣闊的應用前景[4]。本研究通過建立腸衰竭大鼠的動物模型，觀察大黃與甘草合用對血清及結腸組織中炎性因子的影響，探討大黃與甘草合用治療腸衰竭的機制，從而為中藥復方治療腸衰竭提供依據。

1材料與方法

1.1藥品與試劑大黃飲片和甘草飲片購自北京同仁堂(亳州)飲片有限責任公司，大黃素和甘草酸標準品購自中國藥品生物制品檢驗所，冰乙酸購自美國Sigma 公司，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素(IL)-6、IL-8 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自瑞士Roche 公司。

1.2主要儀器Milli-Q超純水儀購自美國Millipore公司；酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3實驗動物2015年6—8月選取SPF級SD大鼠60只，雌性，4～5周齡，體質量(220±15) g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK (京) 2009-0012。動物飼養于23～26 ℃且12 h自動循環熄燈的標準動物房中，自由飲水和飲食，按隨機、雙盲、平行對照試驗設計。

1.4樣品制備取大黃飲片10 g，粉碎后置于100 ml水中，超聲溶解，提取上清液，提取液過0.22 μm微孔濾膜后，減壓濃縮，再用10 ml水復溶，用于動物給藥，甘草飲片的處理方法與大黃飲片相同。另外，分別取大黃飲片和甘草飲片各10 g，粉碎后置于100 ml水中，超聲溶解，提取上清液，過濾后濃縮，復溶于10 ml水中，用于動物給藥。取大黃素和甘草酸標準品100 mg，溶于1 ml純水中，超聲溶解，得到0.1 g/ml母液，按照40 mg/kg 給藥。

1.5分組及腸衰竭模型的建立采用隨機數字表法將大鼠分成空白對照組、模型組、大黃組、甘草組、合用組、標準品組，每組10只。模型組、大黃組、甘草組、合用組、標準品組大鼠經過禁食不禁水24 h后，用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，用聚乙烯導管從肛門插入結腸腔8 cm，將10%冰乙酸1 ml注入腸腔中。30 s后，用0.9%氯化鈉溶液沖洗2次[5]。根據疾病活動指數(DAI)及大體形態損傷評分高于空白對照組判斷造模成功后，大黃組、甘草組、合用組大鼠分別給予5 g/kg大黃、甘草、大黃和甘草溶液灌胃，2次/d，共1周；標準品組大鼠給予40 mg/kg大黃素和甘草酸標準品溶液灌胃，2次/d，共1周；空白對照組和模型組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，2次/d，共1周。

1.6標本采集和處理造模成功并給藥1周后，將大鼠麻醉，稱重，心臟采血4 ml，置于干燥的無菌試管中，室溫靜置，待其自然凝固收縮后，37 ℃水浴20 min。將血液6 000 r/min離心5 min(離心半徑6 cm)，吸取上清液，-20 ℃保存，備用。采血后處死大鼠，取其結腸，沿縱軸切開，用預冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，組織勻漿。將組織液6 000 r/min離心5 min(離心半徑6 cm)，吸取上清液，-20 ℃保存，備用。

1.7結腸炎癥的組織形態評價用甲醛將大鼠部分結腸固定，石蠟包埋之后切片，采用蘇木素-伊紅(HE)染色后觀察組織形態變化。采用DAI、大體形態損傷評分和組織學損傷評分評價結腸炎癥。

1.8血清及結腸組織中TNF-α、IL-6 、IL-8 表達水平應用TNF-α、IL-6、IL-8 ELISA試劑盒，將標準品用稀釋液倍比稀釋，酶標儀測定450 nm波長下各孔吸光度(OD值)。以標準品濃度的對數為橫坐標、測定的OD值為縱坐標做出標準曲線，計算待測樣品濃度[6]。

2結果

2.1組織形態評價處死大鼠，打開腹腔后，模型組、大黃組、甘草組、合用組、標準品組大鼠可見結腸的腸壁已經明顯腫脹、充血；局部有潰爛、明顯的出血點，并可找到新生的潰瘍灶。6組大鼠DAI、大體形態損傷評分及組織學損傷評分比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中與空白對照組比較，模型組、大黃組、甘草組、合用組、標準品組大鼠DAI、大體形態損傷評分及組織學損傷評分升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，大黃組、合用組、標準品組大鼠DAI、大體形態損傷評分及組織學損傷評分降低，甘草組大鼠DAI降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與大黃組比較，甘草組大鼠DAI、大體形態損傷評分及組織學損傷評分升高，合用組大鼠DAI及組織學損傷評分降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與甘草組比較，合用組、標準品組大鼠DAI、大體形態損傷評分及組織學損傷評分降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與合用組比較，標準品組大鼠DAI及組織學損傷評分升高，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.26組大鼠血清及結腸組織TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平比較6組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中與空白對照組比較，模型組、大黃組、甘草組、合用組、標準品組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，大黃組、甘草組、合用組、標準品組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

6組大鼠結腸組織TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中與空白對照組比較，模型組、大黃組、甘草組、合用組、標準品組大鼠結腸組織TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組和甘草組比較，大黃組、合用組、標準品組大鼠結腸組織TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

3討論

本研究采用大黃、甘草單用以及大黃與甘草合用治療腸衰竭模型大鼠，結腸炎癥的組織形態評價證實，大黃與甘草合用可以緩解腸衰竭。抗炎活性的篩選發現，大黃和大黃與甘草合用對血清中3種炎性因子的表達有較強的抑制作用，其中大黃與甘草合用的效果更強，進而又對結腸組織中3種炎性因子的抑制進行了評價，進一步證明甘草的加入使大黃能更好地抑制腸衰竭的炎性反應。

大黃具有瀉下攻積、解毒、清熱瀉火、活血祛瘀之功效，現代藥理學研究證實，其具有建立腸道屏障、促進大腸蠕動、調節腸道菌群和防治微血栓形成的作用，對降低腸衰竭患者病死率具有重要意義[7]。但是大黃同樣具有很強的松弛括約肌、促進膽汁分泌、抑制胰酶分泌等不良反應，對于體質極端衰弱的腸衰竭患者極為不利[8]，因此需要找到與大黃合用的中藥以降低大黃的用量，并增強大黃緩解腸衰竭的作用。大黃和甘草發揮藥效的主要物質基礎為其中的大黃素和甘草酸[9-10]，本研究進一步評價大黃素與甘草酸合用對腸衰竭大鼠體內炎性因子的影響，發現相同濃度的大黃素與甘草酸合用與大黃與甘草合用的抗炎活性比較接近，但還是略有降低，說明大黃與甘草中起聯合抗炎作用的主要成分就是大黃素和甘草酸，其他成分可以增強其抗炎作用。

表16組大鼠DAI、大體形態損傷評分及組織學損傷評分比較

Table 1Comparison of DAI,gross morphological damage score and histological injury score among the 6 groups

組別只數DAI大體形態損傷評分(分)組織學損傷評分(分)空白對照組101.0±0.70.9±0.71.2±0.6模型組109.1±1.2a9.5±1.6a8.9±0.7a大黃組104.2±0.9ab3.8±0.4ab4.1±0.6ab甘草組108.1±0.9abc9.3±0.7ac8.6±0.9ac合用組103.1±0.4abcd3.2±0.4abd3.0±0.3abcd標準品組103.5±0.7abde3.4±0.6abd3.6±0.7abdeF值124.2064.68315.34P值<0.001<0.001<0.001

注：DAI=疾病活動指數；與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與大黃組比較，cP<0.05；與甘草組比較，dP<0.05；與合用組比較，eP<0.05

表2　6組大鼠血清及結腸組織TNF-α、IL-6、IL-8 表達水平比較

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL-6=白介素6，IL-8=白介素8；與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與甘草組比較，cP<0.05

由于腸衰竭的病情進展較快，發病機制尚不明確，至今尚未發現特異的致病因素和致病因子，因此很難構建出完美的模擬腸衰竭的動物模型。本研究所構建的腸衰竭動物模型類似于人類的腸道病理改變，病程也與人類最相近，構建的過程簡便、重現性高、經濟可行。因此可以應用于急、慢性腸衰竭的研究，使腸衰竭的治療研究能夠順利地進行。目前認為，TNF-α、IL-6誘發的炎性反應很大程度上是通過誘導以IL-8為代表的腸衰竭趨化因子的產生而實現的，TNF-α與IL-6及IL-8之間有一定的關聯性，TNF-α可誘導IL-6和IL-8產生[5]。因此，TNF-α、IL-6、IL-8是其中重要的細胞因子和趨化因子，由淋巴細胞、中性粒細胞以及巨噬細胞在外界刺激作用下被激活而釋放，可直接啟動炎性反應或通過刺激其他炎性遞質的釋放，觸發級聯反應，從而形成廣泛炎癥和以血清炎性因子表達升高為特點的全身性炎性反應[11]。腸衰竭發生時，上述促炎細胞因子產生了共同的致炎作用，使腸道細胞產生炎性，過氧化物和溶酶體酶釋放增多，一氧化氮(NO)合成酶活性增高，合成大量NO，增強自然殺傷細胞(NK細胞)的細胞毒性，加速腸衰竭的進程[12]。故而腸衰竭患者的抗炎治療方式在此類疾病的治療中占有重要地位。

綜上所述，本研究證實大黃與甘草合用對腸衰竭大鼠具有抗炎作用，可以有效緩解癥狀，證明了復方配伍具有能夠協同增效抵抗腸衰竭的特點，為指導臨床用藥提供了理論依據。但是，由于大鼠腸衰竭模型的構建步驟較為繁瑣和漫長，模型的評價缺乏有效的客觀實驗依據，今后應該在模型的優化方面進一步展開研究。

作者貢獻：徐鑫進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；孟檸進行實驗實施和模型評估；俞毅君和胡銘榮負責資料收集及數據處理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Effect of the Combined Use of Rheum and Liquorice on Inflammatory Factors in Rats With Intestinal Function Failure

XUXin,MENGNing,YUYi-jun,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedHospitalofHangzhouNormalUniversity,Hangzhou310015,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of the combined use of rheum and liquorice on intestinal function failure and its mechanism.MethodsIn this random,double-blind,parallel and control trial,we selected 60 SPF rats from June to August in 2015 and divided them into six groups,which were blank control group,model group,rheum group,liquorice group,combination group and standard group,by random number table methods and with 10 rats in each group.Rats in model group,rheum group,liquorice group,combination group and standard group were built as intestinal function failure models induced by acetic acid.After model building was completed,rheum group,liquorice group and combination group were respectively given rheum,liquorice and the two together by 5 g/kg;standard group was given gavage with rheum emodin-glycyrrhizic acid by 40 mg/kg;blank control group and model group were given gavage with 0.9% sodium chloride of the same amount.Seven days later,hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the morphological changes of colon tissues.Disease activity index(DAI)，gross morphological damage score and histological injury score were evaluated,and ELISA method was used to detect the expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-8 in serum and colon tissues.ResultsModel group,rheum group,liquorice group,combination group and standard group were higher in DAI,gross morphological damage score and histological injury score compared with blank control group(P<0.05);compared with model group,rheum group,combination group and standard group were lower in DAI,gross morphological damage score and histological injury score,liquorice group was lwoer in DAI(P<0.05);compared with rheum group,liquorice group was higher in DAI,gross morphological damage score and histological injury score and combination group was lower in DAI and histological injury score (P<0.05);combination group and standard group were lower in DAI,gross morphological damage score and histological injury score compared with liquorice group(P<0.05);compared with combination group,standard group was higher in DAI and histological injury score (P<0.05).Model group,rheum group,liquorice group,combination group and standard group were higher in the expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-8 in serum than those of blank control group (P<0.05);the expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-8 in serum of rheum group,liquorice group,combination group and standard group were lower than those of model group(P<0.05).Model group,rheum group,liquorice group,combination group and standard group were higher in the expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-8 in colon tissues than those of blank control group (P<0.05);rheum group,combination group and standard group were lower in the expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-8 in colon tissues compared with model group and liquorice group(P<0.05).ConclusionThe combined use of rhubarb and licorice has synergy anti-inflammatory effects on rats with intestinal function failure,and rheum emodin and glycyrrhizic acid are the substance basis of its major effect.

【Key words】Intestinal function failure；Rheum officinale；Glycyrrhiza uralensis；Chemokines

基金項目：浙江省科技計劃項目(2014C37031)

通信作者：徐鑫，310015浙江省杭州市，杭州師范大學附屬醫院普外科；E-mail:15268536059@163.com

【中圖分類號】R 574

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.15.017

(收稿日期：2015-08-21；修回日期：2016-01-12)

·中醫·中西醫結合研究·